Почему WTB-PCR повышает достоверность валидации мишени?

Метод WTB-PCR повышает достоверность валидации мишени за счет селективной амплификации малочисленных мутантных аллелей при одновременном подавлении сильных сигналов дикого типа, что позволяет точно определять соматические мутации в гетерогенных образцах. Это снижает частоту ложноотрицательных результатов при скрининге мутаций, обеспечивая более надежную оценку взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей в доклинических моделях.

Как блокирование с помощью LNA обеспечивает селективную амплификацию мутантных последовательностей?

Блокирование с помощью LNA основано на специфическом связывании с высокой аффинностью с нитью ДНК дикого типа, что приводит к образованию стабильного гибрида, который ингибирует элонгацию ДНК-полимеразы и предотвращает генерацию ампликонов дикого типа. В течение множества циклов ПЦР это селективное ингибирование увеличивает относительное содержание мутантных ампликонов, что позволяет обнаруживать их даже при низкой частоте встречаемости.

Какие количественные результаты обеспечивает WTB-PCR для детекции мутаций?

Метод WTB-PCR позволяет количественно определить соотношение мутантных аллелей к аллелям дикого типа посредством селективной амплификации, обеспечивая пропорциональный показатель обогащения мутантного аллеля после ПЦР. Полученные данные позволяют проводить сравнительный анализ различных экспериментальных условий, таких как ответ на терапию или генетический фон, в рамках исследовательских и доклинических рабочих процессов.

Почему требования к репликации важны для WTB-PCR при кросс-функциональном взаимодействии?

Требования к воспроизводимости обеспечивают стабильную эффективность блокирования LNA и детектирования мутантных аллелей в разных лабораториях, что крайне важно для получения сопоставимых данных при многоцентровых кампаниях по валидации или скринингу мишеней. Стандартизированные протоколы дизайна олигонуклеотидов и термоциклирования снижают вариабельность, способствуя надежному обмену данными между группами по поиску мишеней, разработке анализов и трансляционным исследованиям.

Какие возможности статистического анализа необходимы перед внедрением WTB-PCR в конвейер поиска новых мишеней?

Перед внедрением командам необходимы статистические инструменты для количественного определения частоты мутантных аллелей по данным ампликонов ПЦР, включая методы расчета коэффициентов обогащения и оценки соотношения сигнал/шум между повторностями. Эти анализы помогают установить пределы обнаружения, определить пороги положительного результата и принять решения о целесообразности дальнейшего проведения исследований (go/no-go) на основе мутантной нагрузки в доклинических моделях.

Блокирующая ПЦР дикого типа для выявления низкочастотных соматических мутаций

JoVE Encyclopedia of Experiments

Биологические методы

0 просмотров • 5:11 мин • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полимеразная цепная реакция дикого типа, или WTB-PCR, обнаруживает точечные мутации путем селективной амплификации мутантных аллелей с низкой численностью и ингибирования амплификации аллелей дикого типа с высокой численностью в образцах ДНК.

В WTB-PCR используются заблокированные нуклеиновые кислоты или содержащие LNA одноцепочечные модифицированные олигонуклеотиды, комплементарные цепи ДНК дикого типа образца, которая специфически связывается с комплементарной цепью. Связывание LNA блокирует активность ДНК-полимеразы и ингибирует удлинение матричной ДНК дикого типа.

Для проведения WTB-ПЦР возьмите мастер-смесь, содержащую dNTP, LNA и прямые и обратные праймеры, специфичные для мишеней, в дистиллированной воде, не содержащей нуклеаз.

Добавьте в пробирку термостабильный раствор, содержащий ДНК-полимеразу, и пипетируйте смесь в лунку ПЦР-планшета. Добавьте в лунку образец геномной ДНК, содержащий ДНК дикого типа и мутантную ДНК, и начните ПЦР.

Во время ПЦР высокотемпературная денатурация разделяет двухцепочечные ДНК. Разделенные нити действуют как матрицы для отжига праймеров, в то время как LNA связывается со своей комплементарной цепью ДНК дикого типа и образует гибрид блокатора и дикого типа ДНК. При более высокой температуре ДНК-полимераза добавляет dNTP и удлиняет матрицы праймер-ДНК.

Более высокая температура плавления гибрида LNA-ДНК, чем у комплекса ДНК-ДНК, сохраняет его нетронутым. Модификация ЛНК в конечном итоге блокирует удлинение ДНК-полимеразы от удлинения гибрида ЛНК-ДНК, что препятствует его удлинению.

В течение нескольких циклов ПЦР LNA-опосредованная блокировка увеличивает количество ампликонов мутантного типа по сравнению с вариантом дикого типа в образце, способствуя их избирательному обнаружению.

Прямые и обратные капсюли были спроектированы с последовательностью 5'-M13, что позволяет проводить отжиг дополнительных капсюлей с секвенированием. Спроектируйте блокирующий олигонуклеотид так, чтобы он имел длину примерно от 10 до 15 оснований и был комплементарен матрице дикого типа, где желательно обогащение мутантами.

Более короткий олиго улучшит распознавание несоответствия. Для достижения высокой специфичности мишени важно не использовать слишком много блокирующих нуклеотидов, так как это приведет к образованию очень «липкого» олигонуклеотида.

Чтобы спроектировать блокирующий олигонуклеотид, начните с перехода на веб-сайт Oligo Tools. Выберите инструмент "Прогнозирование Oligo T_M". Откроется новое окно. Вставьте последовательность шаблона дикого типа, который нужно заблокировать, в поле "Oligo Sequence". Добавьте знак плюс перед основаниями блокираторов, чтобы отметить их. Нажмите на кнопку «Рассчитать», чтобы определить примерное T_M гибрида-блокатора ДНК. Рассчитанные температуры плавления появятся в полях ниже.

Спроектируйте блокирующий олиго так, чтобы температура плавления была на 10–15 градусов Цельсия выше температуры растяжения во время термоциклирования. Здесь температура распространения составляет 72 градуса по Цельсию. Чтобы отрегулировать температуру плавления, добавляйте, удаляйте или заменяйте блокирующие основания. Избегайте длинных отрезков из трех-четырех блокирующих баз C или G.

Далее, чтобы избежать образования вторичной структуры или самодимеризации, вернитесь на главный экран сайта Oligo Tools и выберите инструмент «Оптимизатор Oligo». Откроется новое окно. Вставьте в поле последовательность шаблона типа wild, который нужно заблокировать. Добавьте знак плюс, обозначающий блокирующие базы. Выберите два поля для «Вторичная структура» и «Только для себя» и нажмите кнопку «Анализ», чтобы увидеть баллы за гибридизацию и вторичную структуру.

Эти оценки представляют собой очень грубые оценки температур плавления самодимеров и вторичных структур соответственно. Более низкие баллы являются оптимальными и могут быть достигнуты путем ограничения пары блокатор-блокатор. Удалите или переместите блокирующие нуклеотиды для достижения более низких показателей. Оптимизированный блокирующий олигонуклеотид для MyD88, показанный здесь, обеспечивает баланс между температурой плавления гибрида блокатора ДНК и достаточно низкими показателями гибридизации и вторичной структуры.

Он был разработан для покрытия аминокислот от Q262 до I266 и имеет 3'-инвертированный dT для ингибирования как удлинения ДНК-полимеразой, так и деградации 3'-экзонуклеазой. После того, как праймеры будут сконструированы, настройте блокирующую ПЦР дикого типа и выполните термоциклирование, как описано в сопроводительном документе.