Микросферная полимеразная цепная реакция для амплификации одноцепочечной ДНК

В микросфере-ПЦР используется микроразмерная сфера, связанная с олигонуклеотидами на их поверхности, что обеспечивает преимущественную амплификацию одноцепочечной ДНК.

Чтобы начать микросферную ПЦР, берут реакционную смесь, содержащую матричные одноцепочечные нити ДНК, прямые праймеры с дополнительной нуклеотидной меткой, термостабильную ДНК-полимеразу, дНТП и микросферы, отображающие одноцепочечные олигонуклеотидные зонды.

Поместите трубку в амплификатор и запустите при определенных условиях.

В первом цикле, при температуре отжига, матричная ДНК связывается с зондом на поверхности микросферы таким образом, что матричная ДНК функционирует как смысловая цепь. При удлинении полимераза удлиняет ДНК, а дуплекс остается прикрепленным к микросфере.

В следующем цикле, во время денатурации, матричная ДНК отделяется от микросферы, оставляя цепь зонда связанной с поверхностью, которая служит матрицей для новой цепи.

Во время отжига меченый праймер связывается с антисмысловой нитью. Позже полимераза удлиняет его, чтобы синтезировать смысловую цепь с нуклеотидной меткой.

Повторите цикл несколько раз, чтобы получить несколько копий одноцепочечной ДНК, которые войдут в раствор, в то время как двухцепочечные загрязнители останутся прикрепленными.

Переложите продукты ПЦР в пробирку, содержащую загрузочный буфер. Загрузите средство и маркеры в разные лунки геля, и разделите с помощью электрофореза в агарозном геле.

Матричные ДНК образуют слабую низкомолекулярную полосу, в то время как интенсивная высокомолекулярная полоса подтверждает одноцепочечную амплификацию ДНК.

Получите около 25 микросфер путем микроскопического подсчета с помощью светового микроскопа с 40-кратным увеличением. После этого соедините все реагенты, как описано в текстовом протоколе. Поместите образцы в термоамплификатор и запустите асимметричную ПЦР при соответствующих условиях.

Забор надосадочной жидкости после симметричной ПЦР является одним из наиболее важных этапов, поскольку это основной процесс получения одноцепочечной ДНК с микросферами.

После амплификации добавьте восемь микролитров загрузочного буфера 6X в каждый образец. Загрузите по 15 микролитров каждого образца в 2% агарозный гель. Затем проведите электрофорез при напряжении 100 вольт в течение 35 минут в буфере 1X TAE.