Почему ПЦР на микросферах улучшает валидацию мишени?

Метод Microsphere-PCR позволяет получать чистую одноцепочечную ДНК путем отделения амплифицированных смысловых цепей от двухцепочечных примесей, что снижает количество ложных сигналов в анализах на основе гибридизации, используемых для изучения связывания с мишенью.

Как асимметричная амплификация в методе ПЦР на микросферах помогает в идентификации лидеров?

В данном методе используются меченные праймеры для преимущественного синтеза смысловых цепей, что позволяет получать одноцепочечную ДНК без примесей, повышая достоверность анализа при скрининге ведущих соединений.

Какие количественные измерения позволяет проводить метод ПЦР с микросферами для доклинической оценки?

Метод ПЦР с использованием микросфер позволяет получать количественные одноцепочечные ампликоны ДНК, подходящие для количественного определения с помощью гель-электрофореза, что обеспечивает стабильное измерение изменений экспрессии генов в моделях заболеваний.

Почему требования к воспроизводимости важны для микросферного ПЦР при кросс-функциональном сотрудничестве?

Воспроизводимый сбор супернатанта после амплификации обеспечивает стабильный выход одноцепочечной ДНК, что позволяет надежно обмениваться данными между группами по поиску мишеней, разработке анализов и доклиническим исследованиям.

Какой статистический анализ необходим перед внедрением метода микросферной ПЦР в конвейер поиска новых мишеней?

Реализация требует подтверждения эффективности амплификации и чистоты продукта с помощью повторных экспериментов с последующим статистическим сравнением полос одноцепочечной и двухцепочечной ДНК для подтверждения специфичности.

Микросферная полимеразная цепная реакция для амплификации одноцепочечной ДНК

JoVE Encyclopedia of Experiments

Биологические методы

0 просмотров • 3:02 мин • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В микросфере-ПЦР используется микроразмерная сфера, связанная с олигонуклеотидами на их поверхности, что обеспечивает преимущественную амплификацию одноцепочечной ДНК.

Чтобы начать микросферную ПЦР, берут реакционную смесь, содержащую матричные одноцепочечные нити ДНК, прямые праймеры с дополнительной нуклеотидной меткой, термостабильную ДНК-полимеразу, дНТП и микросферы, отображающие одноцепочечные олигонуклеотидные зонды.

Поместите трубку в амплификатор и запустите при определенных условиях.

В первом цикле, при температуре отжига, матричная ДНК связывается с зондом на поверхности микросферы таким образом, что матричная ДНК функционирует как смысловая цепь. При удлинении полимераза удлиняет ДНК, а дуплекс остается прикрепленным к микросфере.

В следующем цикле, во время денатурации, матричная ДНК отделяется от микросферы, оставляя цепь зонда связанной с поверхностью, которая служит матрицей для новой цепи.

Во время отжига меченый праймер связывается с антисмысловой нитью. Позже полимераза удлиняет его, чтобы синтезировать смысловую цепь с нуклеотидной меткой.

Повторите цикл несколько раз, чтобы получить несколько копий одноцепочечной ДНК, которые войдут в раствор, в то время как двухцепочечные загрязнители останутся прикрепленными.

Переложите продукты ПЦР в пробирку, содержащую загрузочный буфер. Загрузите средство и маркеры в разные лунки геля, и разделите с помощью электрофореза в агарозном геле.

Матричные ДНК образуют слабую низкомолекулярную полосу, в то время как интенсивная высокомолекулярная полоса подтверждает одноцепочечную амплификацию ДНК.

Получите около 25 микросфер путем микроскопического подсчета с помощью светового микроскопа с 40-кратным увеличением. После этого соедините все реагенты, как описано в текстовом протоколе. Поместите образцы в термоамплификатор и запустите асимметричную ПЦР при соответствующих условиях.

Забор надосадочной жидкости после симметричной ПЦР является одним из наиболее важных этапов, поскольку это основной процесс получения одноцепочечной ДНК с микросферами.

После амплификации добавьте восемь микролитров загрузочного буфера 6X в каждый образец. Загрузите по 15 микролитров каждого образца в 2% агарозный гель. Затем проведите электрофорез при напряжении 100 вольт в течение 35 минут в буфере 1X TAE.