$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Вложенная полимеразная цепная реакция, вложенная ПЦР, может избирательно амплифицировать определенные последовательности генов.
Чтобы обнаружить вирусную последовательность-мишень, начните с мастер-микса, содержащего внешние праймеры, комплементарные более крупному участку ДНК, содержащему целевую вирусную последовательность, dNTP и термостабильную ДНК-полимеразу в соответствующем буфере.
Добавьте к этой смеси двухцепочечную вирусную ДНК, извлеченную из инфицированных вирусом клеток. Переложите трубку в термоамплификатор; запустить первый цикл ПЦР.
Во время денатурации двухцепочечная ДНК образует два одноцепочечных шаблона. При соответствующей температуре отжига наружные капсюли связываются с соответствующими последовательностями мишеней. Позже ДНК-полимераза удлиняет праймеры с помощью dNTP, образуя большие ампликоны, содержащие специфическую последовательность внутри амплифицированной ДНК.
Перенесите эти ампликоны в новую трубку. Дополните его свежей мастер-смесью, содержащей внутренние или вложенные праймеры, нацеленные на меньшую, более специфичную последовательность в более крупной амплифицированной ДНК. Проведите вторую ПЦР.
Во время второй ПЦР цепь ДНК денатурируется. После денатурации вложенные праймеры связываются с целевыми сайтами на одноцепочечной матрице, после чего следует полимеразо-опосредованное удлинение праймера.
Повторите второй цикл ПЦР несколько раз, чтобы эксклюзивно амплифицировать целевую вирусную последовательность.
Проанализируйте продукт ПЦР, чтобы визуализировать меньшие ампликоны, подтверждающие наличие конкретной вирусной последовательности.
Достаньте необходимые реагенты и храните их на льду в чистой комнате до использования. Когда все будет готово, разморозьте и закрутите реагенты. Затем приготовьте 48 микролитров смеси для первого раунда ПЦР для каждого образца в центрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра, как указано в таблице 2 текстового протокола, и разделите реакционную смесь на 0,2-миллилитровые ПЦР-пробирки.
На рабочей станции ПЦР в комнате для шаблонов добавьте 2-микролитровый образец кДНК в смесь для первого раунда ПЦР. Включите два микролитра кДНК CVS-11 в качестве положительного контроля и два микролитра дважды дистиллированной воды в качестве отрицательного контроля. Затем переведите запечатанные пробирки в термоамплификатор для ПЦР и выполните цикл с параметрами, перечисленными в таблице 3 текстового протокола.
Для начала приготовьте 48 микролитров смеси для ПЦР второго раунда для каждого образца в центрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра, как указано в таблице 4 текстового протокола, и разделите реакционную смесь на 0,2-миллилитровые ПЦР-пробирки. Добавьте два микролитра продукта ПЦР первого раунда в смесь для ПЦР второго раунда. Включите двойную дистиллированную воду в качестве отрицательного контроля для этого раунда ПЦР. Затем выполните термоциклирование ПЦР с использованием параметров, перечисленных в таблице 3 текстового протокола.