Вложенная ПЦР для обнаружения специфической геномной последовательности вируса
Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:20 мин. • July 8th, 2025
Вложенная полимеразная цепная реакция, вложенная ПЦР, может избирательно амплифицировать определенные последовательности генов.
Чтобы обнаружить вирусную последовательность-мишень, начните с мастер-микса, содержащего внешние праймеры, комплементарные более крупному участку ДНК, содержащему целевую вирусную последовательность, dNTP и термостабильную ДНК-полимеразу в соответствующем буфере.
Добавьте к этой смеси двухцепочечную вирусную ДНК, извлеченную из инфицированных вирусом клеток. Переложите трубку в термоамплификатор; запустить первый цикл ПЦР.
Во время денатурации двухцепочечная ДНК образует два одноцепочечных шаблона. При соответствующей температуре отжига наружные капсюли связываются с соответствующими последовательностями мишеней. Позже ДНК-полимераза удлиняет праймеры с помощью dNTP, образуя большие ампликоны, содержащие специфическую последовательность внутри амплифицированной ДНК.
Перенесите эти ампликоны в новую трубку. Дополните его свежей мастер-смесью, содержащей внутренние или вложенные праймеры, нацеленные на меньшую, более специфичную последовательность в более крупной амплифицированной ДНК. Проведите вторую ПЦР.
Во время второй ПЦР цепь ДНК денатурируется. После
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео