Вложенная ПЦР для обнаружения специфической геномной последовательности вируса

0 просмотров3:20 мин • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вложенная полимеразная цепная реакция, вложенная ПЦР, может избирательно амплифицировать определенные последовательности генов.

Чтобы обнаружить вирусную последовательность-мишень, начните с мастер-микса, содержащего внешние праймеры, комплементарные более крупному участку ДНК, содержащему целевую вирусную последовательность, dNTP и термостабильную ДНК-полимеразу в соответствующем буфере.

Добавьте к этой смеси двухцепочечную вирусную ДНК, извлеченную из инфицированных вирусом клеток. Переложите трубку в термоамплификатор; запустить первый цикл ПЦР.

Во время денатурации двухцепочечная ДНК образует два одноцепочечных шаблона. При соответствующей температуре отжига наружные капсюли связываются с соответствующими последовательностями мишеней. Позже ДНК-полимераза удлиняет праймеры с помощью dNTP, образуя большие ампликоны, содержащие специфическую последовательность внутри амплифицированной ДНК.

Перенесите эти ампликоны в новую трубку. Дополните его свежей мастер-смесью, содержащей внутренние или вложенные праймеры, нацеленные на меньшую, более специфичную последовательность в более крупной амплифицированной ДНК. Проведите вторую ПЦР.

Во время второй ПЦР цепь ДНК денатурируется. После денатурации вложенные праймеры связываются с целевыми сайтами на одноцепочечной матрице, после чего следует полимеразо-опосредованное удлинение праймера.

Повторите второй цикл ПЦР несколько раз, чтобы эксклюзивно амплифицировать целевую вирусную последовательность.

Проанализируйте продукт ПЦР, чтобы визуализировать меньшие ампликоны, подтверждающие наличие конкретной вирусной последовательности.

Достаньте необходимые реагенты и храните их на льду в чистой комнате до использования. Когда все будет готово, разморозьте и закрутите реагенты. Затем приготовьте 48 микролитров смеси для первого раунда ПЦР для каждого образца в центрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра, как указано в таблице 2 текстового протокола, и разделите реакционную смесь на 0,2-миллилитровые ПЦР-пробирки.

На рабочей станции ПЦР в комнате для шаблонов добавьте 2-микролитровый образец кДНК в смесь для первого раунда ПЦР. Включите два микролитра кДНК CVS-11 в качестве положительного контроля и два микролитра дважды дистиллированной воды в качестве отрицательного контроля. Затем переведите запечатанные пробирки в термоамплификатор для ПЦР и выполните цикл с параметрами, перечисленными в таблице 3 текстового протокола.

Для начала приготовьте 48 микролитров смеси для ПЦР второго раунда для каждого образца в центрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра, как указано в таблице 4 текстового протокола, и разделите реакционную смесь на 0,2-миллилитровые ПЦР-пробирки. Добавьте два микролитра продукта ПЦР первого раунда в смесь для ПЦР второго раунда. Включите двойную дистиллированную воду в качестве отрицательного контроля для этого раунда ПЦР. Затем выполните термоциклирование ПЦР с использованием параметров, перечисленных в таблице 3 текстового протокола.

12:14

Дуплексной связи с цифровой ПЦР-анализ для одновременного Количественное определение Enterococcus SPP. И человеческая Фекальные-ассоциированный HF183 Marker в водах

Похожие видео

0 Просмотры

08:54

Разработка и тестирование специфических видов Количественные анализы ПЦР для применения ДНК окружающей среды

Похожие видео

0 Просмотры

11:29

Экономически эффективный метод для отслеживания источника микробного Использование Конкретные человека и животных вирусов

Похожие видео

0 Просмотры

04:31

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Похожие видео

0 Просмотры

12:20

Бактериальный искусственные хромосомы: Функциональный геномики инструмент для изучения Положительный нити РНК вирусы

Похожие видео

0 Просмотры

09:31

Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Похожие видео

0 Просмотры

10:10

Ретровирусное сканирование: определение сайтов интеграции MLV для определения регуляторных областей, специфичных для клеток

Похожие видео

0 Просмотры

08:56

Объединяя анализ ДНК в добыче сырой вириона с анализом РНК от зараженных листьев, чтобы обнаружить новый вирус геномов

Похожие видео

0 Просмотры

11:14

Обнаружение низких копии число комплексных вирусной ДНК, образованный в Vitro инфекции гепатита B

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 1 августа 2026