Мультиплексная капельная полимеразная цепная реакция для обнаружения метилирования ДНК в лейкоцитах

Метилирование остатков цитозина ДНК является характерным признаком лейкоцитов или лейкоцитов.

Мультиплексная капельная полимеразная цепная реакция, или мдПЦР, позволяет одновременно идентифицировать несколько метилированных участков ДНК в лейкоцитах.

Приготовьте смесь, содержащую реакционный буфер, ДНК-полимеразу и воду, не содержащую нуклеаз. Добавьте прямые и обратные праймеры и флуоресцентные гидролизные зонды, специфичные для каждой целевой области. Зонды состоят из флуорофорных репортеров разного цвета, связанных с гасителями, чтобы подавить излучение флуоресценции.

Добавьте бисульфит-преобразованную ДНК, в которой неметилированные цитозины дезаминируются в урацилы, в то время как метилированные цитозины остаются неизменными. Смешивать.

Наполните стеклянный шприц смесью масла-поверхностно-активного вещества, а другой — смесью масла-носителя для ПЦР и подключите их к микрофлюидному генератору капель. Масляно-водная смесь для ПЦР эмульгируется в капли размером менее нанолитра. Поверхностно-активное вещество стабилизирует эмульсию и предотвращает слияние капель.

Соберите капли, и проведите ПЦР. В каждой капле высокая температура денатурации денатурирует двухцепочечную ДНК в одноцепочечную ДНК и активирует полимеразу. Температура реакции снижается, что позволяет проводить отжиг грунтовок и зондов с учетом специфики участка.

По мере того, как полимераза связывается и удлиняет дуплекс ДНК-праймера, урацилы амплифицируются в виде тиминов, в то время как метилированные цитозины амплифицируются в виде цитозинов, что позволяет различать метилированные и неметилированные области. Полимераза далее расщепляет и высвобождает репортер из зонда, вызывая флуоресцентное излучение.

После ПЦР визуализируйте капли под микроскопом. Цвет флуоресценции указывает на наличие специфических метилированных мишеней ДНК.

Для получения капель смешайте 1 микролитр бисульфит-преобразованной ДНК со свежеприготовленной мастер-смесью зонда в ПЦР-пробирке и соберите образец с помощью кратковременного центрифугирования. Используйте фитинги PEEK для подключения одноразовых жидкостных трубок к двум прецизионным стеклянным шприцам объемом 250 микролитров и предварительно заполните один прецизионный стеклянный шприц 250 микролитрами базового масла, содержащего 5% фторсодержащего поверхностно-активного вещества, и один прецизионный стеклянный шприц 50 микролитрами базового масла.

Когда оба шприца будут загружены, загрузите 100 микролитров ПЦР-смеси в шприц с маслом-носителем и поместите капельное микрофлюидное устройство на столик вертикального светового микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой.

Для наблюдения и записи образования капель в режиме реального времени поместите предварительно заполненные шприцы на программируемый шприцевой насос и используйте соединение PEEK с фитингами для подключения трубок шприцев к трубкам соответствующих входных каналов капельного микрофлюидного устройства.

Поместите трубку от выходного отверстия капель-генератора внутрь 0,5-миллилитровой ПЦР-пробирки и отрегулируйте расход шприцевого насоса до 2 микролитров в минуту. Дайте размеру капли стабилизироваться, прежде чем собирать полученную эмульсию. Медленно и осторожно соберите эмульсию с верхней части пробирки, и перелейте 75 микролитров раствора в 200-микролитровую ПЦР-пробирку для термоциклирования.

Затем убедитесь, что содержание масла в ПЦР-пробирке близко соответствует объему дисперсной фазы, чтобы предотвратить коалесценцию капель во время термоциклирования, и поместите 200-микролитровую пробирку в термоамплификатор.