Количественный точечный блоттинг для оценки целевых белков в тканевом лизате

Количественный точечный блоттинг — или QDB — это полезный метод для количественной оценки концентрации целевых белков в образце. После того, как образец иммобилизован на полимерной мембране, белки могут быть обнаружены с помощью иммуноблоттинга.

Для начала возьмем QDB-планшет — многолуночную пластину с нитроцеллюлозной мембраной, прикрепленной к дну каждой лунки. Добавьте образец — лизат ткани, содержащий целевой белок, — в центр мембраны внутри лунки.

Дайте образцу высохнуть. Целевой белок связывается с мембраной посредством нековалентных взаимодействий.

Добавьте решение для блокировки. Белки в растворе прикрепляются к несвязанным участкам на мембране, предотвращая неспецифическое связывание детектирующих реагентов.

Далее добавьте раствор, содержащий первичные антитела, которые связываются с белком-мишенью в образце. Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Затем добавьте вторичный раствор антитела. Эти молекулы, меченные ферментом пероксидаза, связываются с связанными с белком первичными антителами. Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Наконец, добавьте раствор, содержащий хемилюминесцентную подложку и перекись водорода. Используя перекись водорода, связанная с антителами пероксидаза окисляет субстрат и излучает свет. С помощью планшетного ридера измерьте интенсивность люминесценции образца.

Сгенерируйте стандартную кривую люминесценции с помощью последовательного разведения с известными концентрациями целевого белка. Нанесите измеренное значение люминесценции образца на кривую, чтобы определить целевую концентрацию белка.

В этой процедуре поместите пустую коробку с наконечником для пипетки под пластину QDB так, чтобы нижняя часть пластины не касалась поверхности стола. Загрузите до 2 микролитров образца в центр мембраны в нижней части отдельного блока планшета QDB.

Никогда не допускайте, чтобы нижняя часть пластины QDB касалась какой-либо поверхности во время загрузки, и не нагружайте слишком сильно для отдельных колодцев. Вы испытываете не более 4 микролитров на лунку.

Затем оставьте загруженную пластину QDB на один час при комнатной температуре или оставьте загруженную пластину при температуре 37 градусов Цельсия на пятнадцать минут в хорошо проветриваемом помещении. Чтобы заблокировать пластину, опустите пластину QDB в буфер для переноса и осторожно встряхните ее в течение 10 секунд.

После этого осторожно промойте пластину QDB с TBST три раза, а затем промойте тарелку в течение пяти минут в TBST под постоянным встряхиванием. Затем заблокируйте пластину QDB блокирующим буфером на один час при постоянном встряхивании. Теперь разведите первичное антитело в блокирующем буфере в выбранной концентрации и добавьте его по 100 микролитров в каждую отдельную лунку обычного 96-луночного планшета.

Вставьте планшет QDB в планшет на 96 лунок и инкубируйте объединенные планшеты либо в течение двух часов при комнатной температуре, либо в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия при постоянном встряхивании. После этого осторожно промойте тарелку с TBST три раза, прежде чем она будет промыта с TBST три раза - каждый раз в течение пяти минут при постоянном встряхивании.

Далее разведите вторичное антитело в блокирующем буфере в выбранной концентрации и аликвотируйте 100 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем инкубируйте планшет QDB внутри загруженного 96-луночного планшета в течение одного часа при комнатной температуре при постоянном встряхивании. Осторожно промойте пластину QDB три раза с TBST, а затем промойте пластину три раза, по пять минут каждый с TBST при постоянном встряхивании.

Для количественного определения подготовьте субстрат ECL и аликвоту в 96-луночный планшет по 100 микролитров на лунку. Затем вставьте планшет QDB внутрь планшета на 96 лунок на две минуты при постоянном встряхивании. После этого снимите планшет QDB с 96-луночной пластины и кратковременно встряхните, чтобы удалить лишнюю жидкость. Впоследствии поместите пластину на белую пластину с микротитрованием. Затем включите считыватель микропланшетов и выберите пластину с крышкой в пользовательском интерфейсе, прежде чем поместить объединенные пластины внутрь считывателя микропланшетов для количественной оценки.