Количественный вестерн-блоттинг для оценки уровня экспрессии белка

Количественный вестерн-блоттинг — метод, основанный на нормализации общего белка — полезен для количественной оценки целевых уровней экспрессии белка.

Для начала загрузите лизат тканей в лунки полиакриламидного градиентного геля. Лизат содержит целевой белок вместе с другими клеточными белками.

Запустите гель при соответствующем напряжении для электрофоретического разделения белков образца вдоль градиента. По завершении поместите гель поверх полимерной мембраны передаточной стопки.

Подайте электрический ток для переноса отделенных белков на мембрану. Затем поместите мембрану в флуоресцентное пятно с общим белком. Заряженные молекулы красителя в пятне электростатически связываются со всеми белками на мембране.

Добавьте решение для блокировки. Белки в растворе связываются с мембраной, таким образом. предотвращение неспецифического связывания детектирующих реагентов. Добавьте первичное антитело, связывающееся только с белком-мишенью. Затем добавьте вторичное антитело, меченное флуорофором, которое прикрепляется к первичному антителу.

Возбудите образец лазером. Зарегистрируйте флуоресценцию, излучаемую молекулами красителя общего белка и флуорофорами, связанными с антителами, на соответствующих длинах волн.

Чтобы рассчитать нормализованное значение белковой нагрузки, разделите общий сигнал белка каждой полосы на наибольшее значение. Разделите сигнал целевого белка на соответствующее нормализованное значение нагрузки, чтобы определить относительную экспрессию целевого белка.

Для электрофореза установите предварительно отлитый от 4 до 12% градиентного геля Bis-Tris в системе камер для гель-электрофореза и загрузите в лунку 3,5 микролитра стандартного белка. При использовании внутреннего стандарта для нормализации между мембранами загрузите количество, равное другим образцам, в первые три лунки рядом с белковой лестницей, и загрузите по 30 мкг каждого образца в остальные лунки. Затем пропустите образцы через укладывающий гель при напряжении 80 вольт в течение 10 минут, а затем при напряжении 150 вольт еще от 45 до 60 минут.

В конце электрофореза, чтобы собрать передаточный стек, поместите белковый гель на нижний стек, содержащий мембрану из поливинилидендифторида, а затем на фильтровальную бумагу. Используйте промокательный валик, чтобы удалить пузырьки воздуха, и поместите верхнюю стопку на верхнюю часть фильтровальной бумаги, прежде чем снова свернуть стопку, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Перенесите всю стопку в передаточное устройство с электродом с левой стороны устройства и поместите гелевую губку поверх стопки так, чтобы губка была выровнена с соответствующими электрическими контактами на устройстве.

После закрытия крышки выберите и запустите соответствующую программу. В конце программы разрежьте мембрану до гелевого размера и быстро промойте разрезанную мембрану водой двойной дистилляции, прежде чем продолжить окрашивание общим белком.

Для полного окрашивания белка сверните мембрану в 50-миллилитровую трубку белковой стороной внутрь и пометьте мембрану 5 миллилитрами раствора для окрашивания белка на валике в течение 5 минут при комнатной температуре в вытяжном шкафу.

По окончании инкубации быстро промойте мембрану 5 миллилитрами промывочного раствора, ненадолго возвращая трубку на ролик между промывками, с последующим кратковременным промыванием ультрачистой водой. Добавьте к мембране 3 миллиметра блокирующего буфера, и верните мембрану на ролик на 30 минут при комнатной температуре. Замените блокирующий буфер первичным антителом, представляющим интерес, в соответствующей оптимизированной концентрации и инкубируйте мембрану на ролике в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

На следующий день промыть мембрану 6 раз по 5 минут с 5 миллилитрами свежего PBS на одну стирку на валике при комнатной температуре. После последней промывки инкубируйте мембрану с соответствующим раствором вторичного антитела на ролике в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем 3 промывки в течение 30 минут на промывку. После последней стирки высушите мембрану и используйте алюминиевую фольгу, чтобы защитить мембрану от света.

Чтобы получить изображение, поместите мембрану на сканер стороной белка вниз и выберите область сканирования в программном обеспечении. Затем получите изображения в обоих каналах и экспортируйте изображения в соответствующую программу анализа изображений.

Отобразите 700-нанометровый канал, чтобы показать общий результат окрашивания белка, выберите «Анализ» и нарисуйте прямоугольник, чтобы определить область интереса для нормализации. Затем скопируйте и вставьте первую область прямоугольника в каждый отдельный образец, чтобы убедиться, что определенная область имеет одинаковый размер для всех анализируемых полос.

Чтобы количественно оценить концентрацию белка в каждой полосе, скопируйте результаты как общего окрашивания белка, так и интересующего белка в программу для электронных таблиц, а также определите самый высокий сигнал общего окрашивания белка. Затем разделите каждое общее значение сигнала окрашивания белка на это значение, чтобы получить нормализованное значение загрузки белка, и разделите значение сигнала 800 нанометров от каждого отдельного образца на соответствующее нормализованное значение белка, чтобы рассчитать относительный коэффициент экспрессии белка в разных образцах.