Одноклеточный вестерн-блоттинг для определения гетерогенности клеток

Участки воспаления содержат различные иммунные клетки, в том числе моноциты, макрофаги и лейкоциты.

Чтобы идентифицировать гетерогенную популяцию клеток с помощью одноклеточного вестерн-блоттинга, возьмите предварительно гидратированный блоттинг-чип, состоящий из фотоактивируемого полиакриламидного геля, структурированного в виде блоков. Каждый блок имеет многочисленные микроскважины. При разбивке на несколько блоков несколько ячеек захватываются параллельно.

Добавьте суспензию, содержащую гетерогенную популяцию клеток. Размеры скважины позволяют оседать отдельным ячейкам. Погрузите чип в камеру для электрофореза, заполненную соответствующим буфером. Молекулы детергента в буфере разрушают клеточную мембрану, высвобождая клеточное содержимое.

Приложите электрическое поле. Высвобожденные белки мигрируют по гелю, разделяясь на полосы различного размера. Промойте чип промывочным буфером, чтобы удалить неспецифически связанные молекулы, оставив только клеточные белки, в том числе нужные белки-маркеры.

Подвергайте гель воздействию ультрафиолета, активируя его поверхность и обездвиживая белки.

Добавьте коктейль первичных антител, которые специфически связываются с маркерными белками, характерными для каждого типа клеток, образуя комплексы белок-первичные антитела. Диспенсируйте смесь флуоресцентно меченных вторичных антител, которые связываются с соответствующими первичными антителами, мечая соответствующий клеточно-специфический маркерный белок.

Поместите чип в сканер. Измерьте интенсивность флуоресценции, которая пропорциональна уровню экспрессии соответствующего белкового маркера, специфичного для отдельной клетки суспензии образца клетки.

Для анализа одноклеточного вестерн-блоттинга добавьте 1 миллилитр разбавленной одноклеточной суспензии в регидратированную одноклеточную микросхему вестерн-блоттинга на дне 10-сантиметровой чашки Петри. Через пять-пятнадцать минут рассмотрите чип под светлопольной микроскопией. Примерно от 15% до 20% микролунок должны быть заняты одной ячейкой, и менее 2% лунок должны содержать две или более ячейки.

Если чип был правильно загружен, наклоните чашку на 45 градусов и трижды промойте чипс с помощью суспензионного буфера, чтобы удалить все незахваченные ячейки. После последней промывки осторожно загрузите чип в электрофорезную ячейку одноклеточного вестерн-инструмента гелевым краем вверх и покройте весь одноклеточный вестерн-блоттинг буфером для лизиса/бега. Инициируйте лизис клеток и запустите прибор в соответствии с соответствующими параметрами эксперимента.

В конце прогона промойте чип двумя 10-минутными промывками со свежим буфером для стирки за одну стирку при комнатной температуре. После второго промывки добавьте 80 микролитров первичного раствора антитела, представляющего интерес, в камеру для зондирования антител и опустите чип гелеобразной стороной вниз так, чтобы раствор антитела отводился поперек чипа.

Через два часа при комнатной температуре промойте чип три раза в промывном буфере и один раз в воде на шейкере. Инкубируйте чип с подходящим вторичным антителом в течение одного часа при комнатной температуре, защищенном от света. В конце инкубации трижды промойте чипсу с помощью промывочного буфера и вращайте чипсу на ползуне, чтобы удалить остатки промывочного буфера.

Чтобы удалить одноклеточный чип вестерн-блоттинга, поместите 50-миллилитровый штатив для пробирок в водяную баню при температуре 60 градусов Цельсия, чтобы вода находилась всего в 1 сантиметре над штативом. В вытяжной шкаф добавьте 40 миллилитров буфера для отпаривания и 320 микролитров бета-меркаптоэтанола в канистру. Поместите чип в 10-сантиметровую чашку Петри внутрь канистры и заклейте канистру парапленкой.

Затем поместите канистру внутрь решетки для труб на водяную баню. Через 90 минут осторожно переложите чипсы в новую чашку Петри и кратко промойте чип один раз с помощью буфера для промывки, прежде чем добавить 15 миллилитров свежего буфера для промывки в чашку Петри для 15-минутной промывки на шейкере.