Хемилюминесцентный вестерн-блоттинг для переработки белка

CD95 – рецептор смерти – связывается со своими агонистическими антителами, запуская сборку сигнального комплекса, вызывающего смерть, или DISC – мультибелкового комплекса, который рекрутирует прокаспазу 8. В DISC прокаспаза 8 димеризуется и перерабатывается с образованием различных промежуточных продуктов расщепления и, наконец, активной формы, которая инициирует апоптоз.

Для анализа процессинга каспазы-восьми с помощью хемилюминесцентного вестерн-блоттинга берут лизат, содержащий в пробирке ассоциированные с DISC промежуточные продукты расщепления каспазы 8. Дополните это белком А-агарозными антителами против CD95, захваченными в шариках. Антитела к CD95 связываются с компонентом DISC — CD95, образуя белковые комплексы.

Загрузите образец в полиакриламидный гель SDS, чтобы разделить промежуточные продукты иммунопреципитации каспазы 8 разного размера в виде отдельных полос. Поместите гель на промокательную пленку, и подайте электрический ток. Промежуточные продукты каспазы 8 выходят из геля на блоттинговую мембрану.

Обработайте мембрану блокирующим белок-содержащим раствором, чтобы насытить белок-связывающие участки, предотвращая неспецифические связывания.

Добавьте раствор первичны