Северный блот для обнаружения и количественного определения специфической микроРНК в экстракте общей РНК растительной ткани

МикроРНК, микроРНК, представляют собой небольшие одноцепочечные, некодирующие РНК. МикроРНК объединяются в мультибелковый комплекс и в дальнейшем связываются с комплементарными последовательностями мРНК-мишеней для негативной регуляции экспрессии генов.

Чтобы обнаружить специфическую микроРНК из общей РНК из растительных тканей, добавьте гелеобразующий краситель, содержащий трекинговые красители и формамид — РНК-денатурирующее средство. Нагрейте образец, чтобы денатурировать РНК и предотвратить образование вторичной структуры перед электрофорезом.

Загрузите образец и стандартные маркеры РНК в лунки предварительно собранного денатурирующего полиакриламидного геля. Запустите электрофорез, облегчающий разделение фрагментов РНК по размеру.

Перенесите гель на предварительно смоченную фильтровальную бумагу на кассете для электроблоттинга. Направьте на гель пропитанную буфером капроновую промокательную пленку. Затем сложите предварительно смоченную фильтровальную бумагу. Проведите электроблоттинг.

Электрический ток заставляет отрицательно заряженную РНК, в том числе микроРНК, перемещаться из геля на положительно заряженную поверхность нейлоновой мембраны. Подвергать мембрану воздействию ультрафиолета; это сшивает РНК с мембраной, тем самым предотвращая потерю РНК.

Инкубируйте мембрану в гибридизационном буфере, содержащем блокаторы, которые занимают неспецифические участки связывания для снижения фонового шума.

Добавьте радиоактивно меченный РНК-олигонуклеотидный зонд, комплементарный микроРНК, чтобы специфически связываться с ней. Промойте мембрану буфером, удалив несвязанные щупы.

Используйте систему люминофорной визуализации для обнаружения и количественной оценки интенсивности сигнала радиоактивной гибридизации. Сигнал с высоким разрешением указывает на специфическую экспрессию микроРНК в тканях растения.

Остановите предварительный запуск геля.

Тщательно промойте лунки перед загрузкой пробы, чтобы удалить отложения мочевины внутри лунок. Нагрейте ресуспендированные образцы РНК при температуре 98 градусов в течение 1 минуты. Загрузите образцы горячими в лунки с помощью капиллярных наконечников. Избегайте попадания пузырьков воздуха.

Полная загрузка всех образцов и сборка крышки. Запускайте гель при напряжении 80 вольт в течение 3 часов или до полного выделения бромфенола. Используйте для переноса положительно заряженную нейлоновую мембрану. Разрежьте его по размерам стеклянной пластины. Нанесите маркировку на мембрану в правом верхнем углу. Аккуратно поместите мембрану на поверхность стерильной воды Milli-Q. Убедитесь, что этикетка расположена стороной вниз лицом к поверхности воды.

Возьмите чистый противень и приготовьте гелевый бутерброд для электротрансфера. Положите серую сторону кассеты вниз. Налейте 1X TBE немного выше уровня кассеты. Предварительно намочите волокнистую прокладку в 1X TBE, и сожмите ее, чтобы удалить пузырьки воздуха. Отрежьте два листа промокательной бумаги по размеру волокнистой прокладки.

Предварительно намочите лист промокательной бумаги в 1X TBE и положите его на волокнистую подушечку. Удалите пузырьки воздуха, прокатав пластиковой пипеткой по бумаге. Предварительно смочите еще один лист промокательной бумаги в одном 1X TBE и положите его на кассету. Переверните, чтобы удалить пузырьки воздуха. Теперь сэндвич-установка готова к электропереносу.

После завершения электрофореза следует остановить прогон и снять крышку с аппарата. Извлеките ходовую кассету из настройки. Выньте стеклянные пластины из рабочей кассеты.

Аккуратно снимите гель с сборки. Положите его на промокательную бумагу так, чтобы первый загруженный образец РНК находился справа от вас. Аккуратно окуните предварительно смоченную мембрану в 1X TBE и поместите ее на гель лицевой стороной этикетки вниз. Не допускайте высыхания мембраны и геля. Аккуратно переверните, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Обмакните один лист промокательной бумаги в 1X TBE и положите его на мембрану. Удалите пузырьки воздуха. Положите еще один лист промокательной бумаги и удалите пузырьки воздуха. Завершите сэндвич, положив поверх сборки волокнистую прокладку. Плотно закройте кассету.

Поместите трансблот-кассету в модуль. Заполните бак 1X TBE, pH 8,2, до марки блоттинга. Закройте крышку аппарата и перенесите при 10 вольт на ночь при 4 градусах или в холодное помещение. Держите УФ-сшиватель наготове и установите его на 1 200 непосредственно перед завершением электротрансфера.

После завершения переноса извлеките кассету из модуля. Поместите влажную мембрану на лист формата А4 отмеченной стороной вверх. Сшивайте РНК с мембраной путем облучения 254-нанометровым ультрафиолетовым светом с частотой 120 миллиджоулей. Сшитый блот может храниться при температуре 4 градуса или использоваться для гибридизации.

Разработайте зонд, который полностью комплементарен малой РНК, которую необходимо обнаружить, и пометьте зонд на его 5 основных концах с помощью фермента PNK, и объедините компоненты, как показано на рисунке. Инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов в течение 30 минут.

После 30 минут инкубации с помощью колонок G-25 отделите немаркированные зонды от реакционной смеси. Для улучшения маркировки щупа подготовьте колонку G-25 перед использованием. Поместите блотку стороной РНК вверх внутрь бутылки для гибридизации. Перед использованием энергично перемешайте буфер для гибридизации. Добавьте 10 мл буфера для гибридизации и поместите бутылку для гибридизации в печь для гибридизации, поддерживаемую при температуре 35 градусов при вращении.

Проведите предварительную гибридизацию в течение 20-30 минут. После предварительной гибридизации достаньте бутылку из духовки. Аккуратно добавьте помеченный зонд в буфер для гибридизации. Следите за тем, чтобы не образовывались пузырьки воздуха. Выдерживаем кляксу внутри духовки при температуре 35 градусов с вращением в течение 12 часов.

После гибридизации извлеките буфер для гибридизации из бутылки. Выполните быструю промывку клякс с помощью промывочного буфера I. Этот этап выполняется для удаления излишков гибридизационного раствора из блоток. Далее инкубируйте блотки при температуре 35 градусов в течение 30 минут, используя буфер для промывки I. Проведите еще одну промывку с использованием буфера II при температуре 35 градусов в течение 30 минут.

Смыв кляксу, поместите ее внутрь крышки для гибридизации, удалите излишки буфера и запечатайте. Поместите его в кассету и подвергните воздействию безрадиационного люминофорного экрана в течение 12 часов. Определите сигнал гибридизации с помощью биомолекулярного сканера Typhoon и проанализируйте результаты с помощью программного обеспечения ImageJ.