Полевое биосенсорное биосенсорное управление на основе графенового биосенсора для обнаружения белок-белковых взаимодействий

Белок-белковые взаимодействия, ИПП, имеют решающее значение в регулировании большинства биологических процессов.

Чтобы определить ИПП с помощью полевого биозондирования, начните с графенового полевого транзисторного чипа. Чип содержит функционализированную карбоксилом графеновую поверхность в качестве полупроводникового канала между исходным и дренажным электродами.

Инкубируйте чип со свежим раствором карбодиимида и N-гидроксисульфосукцинимида, сульфо-NHS, в цвиттер-ионном буфере. Этот буфер создает подходящий pH, позволяя карбодиимиду и сульфо-NHS активировать функционализированные карбоксильные группы чипа, образуя аминоактивные эфиры.

Добавьте раствор целевого белка. Первичные амины вступают в реакцию с аминоактивными эфирами, иммобилизуя белки на чипе за счет образования амидных связей. Добавьте аминосодержащий гасящий раствор для блокировки несвязанных аминоактивных эфиров, предотвращая неспецифическое связывание.

Вставьте чип в электронный считыватель и откалибруйте его с помощью буфера. Считыватель подает постоянное напряжение между электродами. Измеряется результирующее протекание электрического тока между электродами в состоянии «анализируемый-несвязанный».

Добавьте самую низкую концентрацию аналита. Взаимодействие между белками аналита и мишенями, обездвиженными на чипе, изменяет локальное распределение заряда поверхности графена, регистрируемое как I-отклик — изменение протекания тока между электродами.

После записи промойте буфером для диссоциации связанных аналитов. Повторите анализ с увеличением концентрации аналита.

Постепенное увеличение I-реакции с увеличением концентрации аналита указывает на сильные ИПП между мишенью и анализируемым организмом.

Начните со смешивания равных объемов EDC и раствора сульфо-NHS путем пипетирования вверх и вниз. Поместите поставляемые компанией биосенсорные чипы в стеклянную чашку Петри с закрытой крышкой. Все этапы функционализации, связанные с активацией чипа, предлагается выполнять в чашке Петри. Нанесите 50 микролитров 1 молярного MES-буфера на чип биосенсора. Выдерживать 1 минуту при комнатной температуре.

Затем аспирируйте буфер и немедленно нанесите 50 микролитров раствора EDC/sulfo-NHS на чип датчика. Накройте чашку Петри крышкой и выдержите 15 минут при комнатной температуре. Аспирируйте раствор EDC/sulfo-NHS из чипа и нанесите 50 микролитров 1 молярного буфера MES.

Аспирируйте MES буфер и дважды промойте чип 50 микролитрами 1x PBS. Отсадите PBS из чипа и добавьте целевую молекулу Hsp90. Накройте стеклянную чашку Петри крышкой и выдерживайте в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем аспирируйте раствор, содержащий целевую молекулу, и трижды промойте 50 микролитрами 1x PBS.

Отсадите 1x PBS раствор из чипа, и добавьте 50 микролитров раствора Quench 1. Накройте стеклянную чашку Петри, и выдержите 15 минут при комнатной температуре. Отсадите раствор Quench 1 из чипа, и добавьте 50 микролитров раствора Quench 2. Накройте стеклянную чашку Петри крышкой и выдержите 15 минут при комнатной температуре. После этого отсасывайте раствор Quench 2 из чипа, и промойте чип пять раз, используя 50 микролитров 1X PBS, оставив последнюю каплю PBS на датчике.

Приготовьте серию разбавления аналита для Cdc37 в желаемом диапазоне концентраций. Спланируйте эксперимент таким образом, чтобы включить не менее восьми различных концентраций аналита для получения надежной константы диссоциации или значения K_d, и приготовьте эти различные разведения в одном и том же буфере, используемом для калибровки, и в белке-мишени.

Осторожно поместите чип в прибор. Убедитесь, что программное обеспечение включено, а светодиодный индикатор загорается зеленым цветом. Далее нажмите на модуль «Запустить эксперимент» в автоматизированном программном обеспечении и выберите «10 точек с регенерацией» или любой другой нужный протокол. Заполните такие данные, как имя оператора, название эксперимента, дата, буфер регенерации, обездвиженная мишень и аналит в растворе. Нажмите кнопку «Начать эксперимент», отображаемую на программном обеспечении, и следуйте инструкциям, отображаемым автоматическим программным обеспечением.

Чтобы выполнить калибровку прибора, отберите оставшийся раствор PBS из микросхемы и внесите 50 микролитров калибровочного буфера. Нажмите кнопку «Продолжить» и подождите пять минут, пока этап калибровки не будет завершен. Программное обеспечение отображает конечную точку, определенную для этапа калибровки, с предупредительным сигналом тревоги, который необходимо выполнить.

Затем выполните ассоциацию аналита, отасунув калибровочный буфер из чипа и введя 50 микролитров самой низкой концентрации аналита. Нажмите кнопку «Продолжить» и подождите пять минут, пока не завершится этап ассоциации. Программное обеспечение отображает конечную точку для шага ассоциации с предупредительным сигналом тревоги для продолжения работы.

Чтобы выполнить диссоциацию аналита, необходимо аспирировать раствор аналита из чипа и нанести 50 микролитров буфера для диссоциации. Нажмите кнопку «Продолжить». После завершения этапа диссоциации программное обеспечение отображает конечную точку этапа диссоциации с предупреждающим сигналом тревоги.

Далее выполните регенерацию чипа путем аспирации диссоциативного раствора из чипа и применения 50 микролитров буфера для регенерации. Затем нажмите кнопку «Продолжить». Этап регенерации обычно занимает около 30 секунд. После этого программное обеспечение отображает конечную точку этапа регенерации с предупредительным сигналом тревоги.

Наконец, для промывки чипа отсасывайте регенерационный раствор из чипа и наносите 50 микролитров промывочного буфера. Откачайте раствор из чипа и повторите это пять раз. Оставьте последнюю каплю буфера для промывки на чипе. Затем нажмите кнопку «Продолжить» и подождите 30 секунд, пока на дисплее программного обеспечения не закончится этап стирки.

Повторите шаги для каждой используемой концентрации аналита. Пять этапов калибровки, ассоциации аналитов, диссоциации, регенерации и пятикратной промывки составляют один цикл.