Массовая фотометрия для изучения антиген-антителенных взаимодействий на уровне одной молекулы
JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 5:16 мин • July 8th, 2025
Чтобы обнаружить антиген-антителенные взаимодействия с помощью массовой фотометрии, сначала инкубируйте желаемую концентрацию очищенных антигенов и антител в течение необходимого периода времени, способствуя связыванию антиген-антитело. Основываясь на стехиометрии связывания антигена, паратопные области этих антител могут иметь различное количество присоединенных антигенов.
Пропустите раствор, содержащий свободные антитела вместе с комплексами антиген-антитело, через предварительно собранную проточную камеру. Закрепите камеру на предметном столике микроскопа массового фотометра. Затем направьте лазерный луч через проточную камеру для получения оптимального изображения.
В зависимости от количества присоединенных антигенов к каждому антителу молекулярная масса комплексов изменяется. Эти изменения массы приводят к тому, что комплексы по-разному рассеивают свет.
Комплексы с более высокой молекулярной массой, в которых два антигена связаны с обоими паратопами одного антитела, рассеивают больше света по сравнению с комплексами, содержащими один антиген. Кроме того, свободные антитела демонстрируют наименьшее рассеяние света.
Детектор собирает рассеянный свет и измеряет его частоту и интенсивность. Фотометр регистрирует флуктуации рассеянного света в виде интерференционной картины, представляя ее в виде пятен.
Слабые пятна соответствуют свободным антителам. Напротив, очень темные пятна представляют собой комплексы с двумя антигенами, а менее темное пятно содержит один связанный антиген.
Наличие темных пятен соответствует взаимодействию антиген-антитело.
Чтобы оценить аффинность антитело-антиген с помощью массовой фотометрии, нанесите каплю иммерсионного масла микроскопа на объектив прибора и поместите проточную камеру на предметный столик микроскопа. Добавьте 10 микролитров отфильтрованного PBS на один конец канала проточной камеры. Буфер будет поступать в канал за счет капиллярного действия.
На вкладке «Управление фокусировкой» программного обеспечения для сбора данных используйте кнопки «Вверх» и «Вниз» для грубого движения сцены для выполнения первоначальных корректировок и нажмите «Резкость», чтобы просмотреть показания сигнала резкости. Используйте тонкие кнопки регулировки вверх и вниз, чтобы максимизировать значение резкости, и нажмите «Установить фокус» и «Зафиксировать фокус», чтобы активировать функцию слежения за фокусом. Изображение чистого слайда должно иметь значение «сигнала», равное или меньше 0,05%.
Загрузите 20 микролитров первого образца антитела-антигена, как показано на рисунке, промокнув жидкость с другого конца небольшим кусочком промокательной бумаги. Сразу после загрузки нажмите кнопку Запись, чтобы получить соответствующее количество кадров, эквивалентное 100 секундам данных. В конце периода сбора данных введите имя файла для данных и нажмите OK, а затем Sample, чтобы сохранить файл.
Чтобы проанализировать данные массовой фотометрии, откройте интересующий файл и нажмите кнопку Анализировать. Нажмите кнопку Загрузить, чтобы загрузить функцию калибровки, и нажмите кнопку Файл и сохранить результаты как, чтобы сохранить проанализированные данные.
Чтобы получить относительные концентрации каждого вида в образце, откройте файл "eventsFitted.csv", скопируйте данные в столбце M в соответствующее программное обеспечение для построения графиков и анализа и используйте функцию "График/статистика/гистограмма" для построения графика распределения молекулярной массы. Дважды щелкните гистограмму, чтобы открыть окно «Свойства графика», отключите автоматическое биннинг и выберите размер ячейки 2,5 килодальтоны.
Чтобы создать данные центров ячеек и подсчетов, нажмите кнопку Применить и начать. Чтобы подогнать гистограмму с помощью гауссовских функций, выберите столбцы «Центры ячеек» и «Количества» и выберите функции меню «Анализ/Пики» и «Базовая линия/Аппроксимация нескольких пиков». Дважды щелкните мышью, чтобы указать приблизительные положения пиков на графике распределения, и нажмите кнопку Открыть NLFit.
Отметьте флажками «Фиксированные» для центров «xc» и установите их значения в соответствии с ожидаемой молекулярной массой свободного антитела и комплексов один и двойной антиген-антитело. Отметьте параметры ширины в опции «Поделиться» и нажмите «По размеру».
Подогнанные значения высоты пика гауссовых компонент представляют собой относительную концентрацию каждого вещества в образце. Затем используйте уравнение для вычисления доли концентрации каждого вида на основе значений пиковой высоты.
Обзор
В данной статье описывается метод обнаружения взаимодействий антиген-антитело с помощью масс-фотометрии. Этот метод позволяет оценивать аффинность антител к антигену путем измерения светорассеяния комплексов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Масс-фотометрия
- Биохимические взаимодействия
- Характеристика антител
Теоретическая часть
- Взаимодействия антиген-антитело играют ключевую роль в различных биологических процессах.
- Масс-фотометрия предлагает новый подход к изучению этих взаимодействий.
- Метод основан на анализе рассеяния света для определения изменений молекулярной массы.
- Понимание этих взаимодействий может способствовать разработке терапевтических антител.
Цель исследования
- Разработать протокол для детектирования комплексов антиген-антитело.
- Проанализировать аффинность антител к их антигенам.
- Использовать масс-фотометрию для наблюдения событий связывания в режиме реального времени.
Используемые методы
- Инкубация очищенных антигенов и антител для облегчения связывания.
- Пропускание раствора через проточную кювету для получения изображений.
- Использование масс-фотометра для детектирования паттернов рассеяния света.
- Анализ данных для определения относительных концентраций комплексов.
Основные результаты
- Комплексы с несколькими антигенами рассеивают свет иначе, чем свободные антитела.
- Темные пятна при визуализации соответствуют комплексам антиген-антитело.
- Анализ данных позволяет определить концентрационные доли каждого вида молекул.
- Аппроксимация гистограмм функциями Гаусса дает представление о распределении молекулярных масс.
Выводы
- Масс-фотометрия является эффективным методом изучения взаимодействий антиген-антитело.
- Данный метод позволяет осуществлять мониторинг событий связывания в режиме реального времени.
- Результаты могут быть использованы для разработки более эффективных антител.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Масс-фотометрия позволяет проводить анализ взаимодействий антигена и антитела на уровне отдельных молекул без использования меток, обеспечивая прямое измерение стехиометрии связывания и образования комплексов. Эта возможность способствует валидации мишеней на ранних этапах, предоставляя количественные данные об аффинности без артефактов, связанных с иммобилизацией или мечением. Данный метод ускоряет поиск перспективных соединений-лидеров, обеспечивая получение данных в режиме реального времени о гетерогенности связывания и стабильности комплексов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает возможность прямого наблюдения за событиями связывания антигена с антителом на уровне отдельных молекул для подтверждения гипотез о взаимодействии с мишенью.
- Практическая ценность: обеспечивает безмаркерное детектирование, которое сохраняет нативную конформацию белка и позволяет избежать артефактов, возникающих при использовании флуоресцентных или ферментативных меток.
- Прогностическая ценность: предоставляет количественные данные о сдвиге массы для разграничения свободных антител, одиночно и дважды связанных комплексов с целью ранжирования по аффинности.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать распределения молекулярных масс, которые позволяют разделять сосуществующие виды компонентов в гетерогенных смесях антител и антигенов.
- Практическая ценность: обеспечивает быструю оценку гомогенности связывания для панелей антител с использованием минимальных объемов образцов.
- Готовность анализа: позволяет получать данные интерференционных картин, пригодные для автоматизированных рабочих процессов аппроксимации пиков с целью определения относительных концентраций компонентов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: позволяет оценивать варианты антител для обеспечения стабильного поведения связывания на всех этапах разработки.
- Механистическое снижение рисков: уточняет стехиометрию связывания для прогнозирования эффекторных функций Fc и снижения риска отбраковки препаратов на поздних стадиях.
- Согласование с биомаркерами: позволяет коррелировать показатели аффинности, полученные методом масс-фотометрии, с результатами функциональных анализов в системах, имеющих значение для конкретного заболевания.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Масс-фотометрия вписывается в непрерывный процесс поиска лекарственных средств — от начальной валидации мишени до оптимизации соединений-лидеров, обеспечивая ортогональное подтверждение данных о связывании, полученных с помощью SPR или ELISA.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез за счет визуализации формирования и диссоциации комплексов в растворе в режиме реального времени.
- Скрининг: обеспечивает количественное определение молекулярной массы, что позволяет сравнивать профили связывания различных кандидатов в антитела.
- Аналитика: предоставляет распределения молекулярных масс в виде гистограмм и аппроксимацию пиков функцией Гаусса для количественного определения концентраций форм.
- Трансляционные исследования: связывает измерения стехиометрии связывания с прогнозами доклинической эффективности посредством анализа стабильных профилей взаимодействия с антигеном.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой мобильную платформу без использования меток, применимую в нескольких кампаниях по поиску антител без необходимости повторной разработки реагентов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет разрешения гетерогенности связывания на уровне отдельных молекул.
- Практическая ценность: Повышает воспроизводимость благодаря стандартизированной работе проточной камеры и программному управлению фокусировкой.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет снижения зависимости от ресурсоемких анализов при первичном скрининге аффинности.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию перспективных антител с учетом рисков на основе количественных данных о формировании комплексов.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области очистки белков и оптимизации буферов для минимизации неспецифических взаимодействий.
- Зависит от наличия откалиброванного масс-фотометра со стабильным лазерным освещением и чувствительным детектором.
- Необходимы стандартизированные протоколы подготовки образцов для обеспечения стабильной работы проточной кюветы.
- Требует учета особенностей адаптации для различных форматов антител (например, Fab, scFv, IgG) и валентности антигенов.
- Ограничено порогом разрешения по молекулярной массе, что может затруднить детектирование малых гаптенов или низкомолекулярных антигенов.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Антитела к специфическому связыванию Каппа (Vκ) легкой цепи, содержащей человека (IgM) Антитела: полисиаловая кислота (PSA) Прикрепленный к NCAM как Case Study
Похожие видео
0 Просмотры
Определение высокого сродства антитело-антиген-связывающий Kinetics с использованием четырех биосенсор платформы
Похожие видео
0 Просмотры
Молекулярные и иммунологические методы в генетически модифицированной мышиной модели стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта
Похожие видео
0 Просмотры
В естественных условиях обнаружения белок-белковых взаимодействий на микро-узорной поверхности
Похожие видео
0 Просмотры
Сочетание Манипуляции одиночных молекул и визуализации по изучению взаимодействий белок-ДНК
Похожие видео
0 Просмотры
Измерение ТКР ПКИКЖ Связывание
Похожие видео
0 Просмотры
Одной молекулы флуоресцентной микроскопии на Planar Поддерживаемые Бислои
Похожие видео
0 Просмотры
Высоко мультиплексированная, высокоразрешающая визуализация т-клеток с использованием madSTORM
Похожие видео
0 Просмотры
Быстрое определение антител-антигена Аффинити по массовой фотометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ образования белковых комплексов при микромолярных концентрациях путем сопряжения микрофлюидики с массовой фотометрией
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026