Анализ клеточной агрегации для выявления транс-взаимодействий между молекулами клеточной адгезии

В нервной системе трансцеллюлярные взаимодействия — взаимодействия между специфическими молекулами адгезии синаптических клеток, трансмембранными белками, на пресинаптических и постсинаптических нейронах — образуют комплекс в синапсах, опосредуя транссинаптическую сигнализацию.

Чтобы обнаружить трансцеллюлярные взаимодействия между молекулами адгезии синаптических клеток, экспрессируемыми на эмбриональных клетках почек человека с помощью анализа клеточной агрегации, начните с трансфицированных клеточных суспензий.

Одна трансфицированная клеточная популяция экспрессирует желаемую молекулу пресинаптической клеточной адгезии и зеленый флуоресцентный белок; другая экспрессирует специфическую молекулу постсинаптической клеточной адгезии и красный флуоресцентный белок. Также получены две клеточные популяции, экспрессирующие зеленые и красные флуоресцентные белки.

Центрифугируйте клетки. Ресуспендируйте клетки в подходящей среде с добавлением ионов кальция. Равномерно смешайте трансфицированные клетки обеих популяций в одной пробирке. Повторите то же самое для других популяций клеток.

Во время инкубации ионы кальция связываются с определенным участком пресинаптического белка, экспрессируемого в клеточной популяции. Это увеличивает взаимодействие пресинаптического белка с постсинаптическим лигандом другой клеточной популяции, способствуя связыванию, опосредуя гетерофильную адгезию между этими клетками и приводя к клеточной агрегации.

Под флуоресцентным микроскопом визуализируйте клетки с помощью подходящих каналов, визуализируя зеленую и красную флуоресценцию клеток. Обработайте изображения.

В клеточных популяциях, экспрессирующих только флуоресцентные белки, не наблюдается агрегации. Агрегация клеток визуализируется как желтая из-за перекрытия между зелеными и красными флуоресцентными клетками, экспрессирующими молекулы адгезии синаптических клеток, что предполагает трансцеллюлярные взаимодействия между молекулами.

Через 48 часов после трансфекции HEK293T клеток соберите клетки из 6-луночного планшета для агрегации. Сначала промойте каждую лунку дважды PBS. Далее, чтобы аккуратно диссоциировать клетки, добавьте в каждую лунку по 1 миллилитру 10-миллимолярной ЭДТА. Затем инкубируйте пластину при температуре 37 градусов по Цельсию.

После пяти минут инкубации осторожно постучите по пластине, чтобы отделить ячейки, и соберите каждую лунку в отдельную 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифугируйте пробирки при давлении 500 х г при комнатной температуре в течение 5 минут.

Пока клетки гранулируются, подготовьте шесть инкубационных пробирок, пометив верхушки микроцентрифужных пробирок условиями эксперимента. Следует использовать все перестановки GFP и mCherry.

Удалите надосадочную жидкость из 15-миллилитровых конических пробирок, и повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах среды. С помощью гемоцитометра подсчитайте клетки в каждой конической трубке. Затем аликвотируйте 200 000 клеток из каждого состояния в соответствующую инкубационную пробирку для получения смеси один к одному в общем объеме 500 микролитров. Поместите инкубационные пробирки в медленный вращатель трубок при комнатной температуре.

Чтобы оценить агрегацию, на исходном уровне и снова через 60 минут нанесите пипетку объемом 40 микролитров из инкубационной пробирки на заряженное предметное стекло микроскопа. Получение исходного уровня должно быть произведено как можно быстрее после добавления ячеек в микроцентрифужную пробирку.

Изобразите предметное стекло под флуоресценцией в зеленом и красном каналах. Для каждого слайда делайте снимки трех разных полей зрения в одной фокальной плоскости.