Анализ бесконтактного лигирования для изучения белок-белковых взаимодействий in situ

Начните анализ близости-лигирования с взятия препарированных нематод и закрепления их на предметном стекле с обнаженными клетками зародышевой линии. Эти клетки демонстрируют высокий уровень рибонуклеопротеиновых комплексов, содержащих РНК-связывающие белки, RBP, связанные с их белками-партнерами.

Наложите на предметное стекло два первичных антитела, которые распознают два специфических белка-мишени — RBP и его белок-партнер. Дополните слайд двумя типами вторичных антител, специфичных к соответствующим первичным антителам.

Каждое вторичное антитело конъюгировано с зондами PLA — нитями ДНК с комплементарными последовательностями. Вторичные антитела связываются с предварительно присоединенными первичными антителами, сближая два зонда PLA.

Нанесите буфер для лигирования, содержащий олигонуклеотиды коннекторов, которые гибридизуются с зондами PLA, и фермент лигазы запечатает разрыв, генерируя кольцевую ДНК. Инкубируйте предметное стекло с раствором для амплификации, содержащим ДНК-полимеразу, dNTP и детекторные зонды, прикрепленные к красному флуорофору.

Используя циркулярную ДНК в качестве матрицы, полимераза инициирует амплификацию по вращающемуся кругу, генерируя множество копий матр