Анализ бесконтактного лигирования для изучения белок-белковых взаимодействий in situ

Начните анализ близости-лигирования с взятия препарированных нематод и закрепления их на предметном стекле с обнаженными клетками зародышевой линии. Эти клетки демонстрируют высокий уровень рибонуклеопротеиновых комплексов, содержащих РНК-связывающие белки, RBP, связанные с их белками-партнерами.

Наложите на предметное стекло два первичных антитела, которые распознают два специфических белка-мишени — RBP и его белок-партнер. Дополните слайд двумя типами вторичных антител, специфичных к соответствующим первичным антителам.

Каждое вторичное антитело конъюгировано с зондами PLA — нитями ДНК с комплементарными последовательностями. Вторичные антитела связываются с предварительно присоединенными первичными антителами, сближая два зонда PLA.

Нанесите буфер для лигирования, содержащий олигонуклеотиды коннекторов, которые гибридизуются с зондами PLA, и фермент лигазы запечатает разрыв, генерируя кольцевую ДНК. Инкубируйте предметное стекло с раствором для амплификации, содержащим ДНК-полимеразу, dNTP и детекторные зонды, прикрепленные к красному флуорофору.

Используя циркулярную ДНК в качестве матрицы, полимераза инициирует амплификацию по вращающемуся кругу, генерируя множество копий матричной ДНК, соединенных друг с другом. Амплифицированная ДНК остается привязанной к зонду PLA, что позволяет локализовать белок-белковое взаимодействие.

Зонды детектора, несущие короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, взаимодействуют с комплементарными участками амплифицированной ДНК, образуя дуплексы и передавая сигналы флуоресценции белковым комплексам. Визуализируйте предметное стекло под флуоресцентным микроскопом.

Наблюдайте за отчетливыми красными пятнами внутри клетки, указывающими на успешное белок-белковое взаимодействие.

Используйте разбавитель антител для разбавления первичных антител. Нанесите на предметные стекла 40 микролитров разведенного первичного раствора антитела на расстояние 14 на 14 миллиметров. Поместите предметные стекла во влажную камеру и выдерживайте в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

Утром промойте слайды дважды по 5 минут каждый с 50 миллилитрами 1x буфера для стирки А при комнатной температуре в банке Coplin. Установите банку Coplin на орбитальный шейкер, установленный на 60 об/мин. Поместите слайды на бумажное полотенце, чтобы буфер для стирки стекал с предметного стекла, и аккуратно протрите края.

Приготовьте 40-микролитровый раствор, содержащий плюсовые и минусовые щупы. Добавьте раствор в каждое пространство размером 14 на 14 миллиметров. Инкубируйте предметные стекла во влажной камере в течение 1 часа при температуре 37 градусов Цельсия. Промойте предметные стекла дважды в течение 5 минут каждый с 50 миллилитрами 1x буфера для стирки А при комнатной температуре в банке Coplin.

Установите банку Coplin на орбитальный шейкер, установленный на 60 об/мин. Разбавьте буфер для лигирования от 1 до 5 сверхчистой водой. С помощью этого буфера разводят лигазу от 1 до 40 для приготовления рабочего запаса раствора для лигирования. Положите горку на бумажное полотенце, чтобы буфер для стирки стекал по бокам, и аккуратно протрите края.

Добавьте по 40 микролитров раствора для лигирования в каждое пространство размером 14 на 14 миллиметров. Инкубируйте предметные стекла во влажной камере в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После мытья и сушки предметных стекол, как описано ранее, добавьте 40 микролитров свежеприготовленного раствора для усиления, защищенного от света, на каждое пространство размером 14 на 14 миллиметров.

Инкубируйте предметные стекла во влажной темной камере в течение 1 часа 40 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Промойте предметные стекла дважды в течение 10 минут каждый с 50 миллилитрами 1x буфера для стирки B, и промойте слайды один раз в течение 1 минуты с 50 мл 0,01x буфера для стирки B.

После прорисовки периметра предметного стекла с эпоксидным покрытием добавьте 10 микролитров монтажного материала в каждый образец и аккуратно положите сверху покровное стекло, позволяющее монтажному материалу разрастись. Покрасьте край покровного стекла лаком для ногтей, чтобы запечатать покровное стекло и горку. Не перемещайте покровную крышку. Дайте лаку застыть не менее 20 минут при комнатной температуре, защищенной от света.