Расщепление белков на мембране для получения ко-иммунопреципитированных белков для исследований взаимодействия

Для выполнения мембранного расщепления принимают раствор ко-иммунопреципитированных белковых комплексов, каждый из которых содержит рекомбинантный GFP-меченый целевой белок, связанный с его партнерским белком.

Перенесите белки в пробирку, содержащую предварительно увлажненный поливинилидендифторид, мембрану из ПВДФ, и инкубируйте. Гидрофильная поверхность мембраны PVDF помогает переносу белков на мембрану.

Перенесите белоксодержащую мембрану в свежую пробирку. Добавьте буфер, содержащий восстановитель, чтобы уменьшить дисульфидные связи между остатками цистеина, что приводит к денатурации отдельных белков в комплексах без нарушения их взаимодействия.

Замените этот раствор алкилирующим реагентом, который алкилирует сульфгидрильную группу обоих белков в комплексах и препятствует образованию дисульфидных связей. Промойте мембрану, чтобы удалить излишки реагента.

Обработайте мембрану буфером, содержащим трипсин — протеолитический фермент. Трипсин расщепляет целевой белок, меченный GFP, и его партнерский белок на карбоксильных окончаниях остатков аргинина и лизина, высвобождая более мелкие пептиды в надосадочную жидкость. Переложите надосадочную жидкость в свежую трубку.

Промойте мембрану кислым раствором, отделив от мембраны все связанные пептиды, обеспечив полную экстракцию. Соберите пептидсодержащие фракции в одну пробирку. Высушите с помощью вакуумной сушки.

Ресуспендировать остатки в низкой концентрации муравьиной кислоты, растворяя пептиды, готовые к идентификации белок-белкового взаимодействия.

Чтобы подготовить мембрану, разрежьте мембраны из ПВДФ на кусочки размером 3 на 3 миллиметра с помощью хирургических ножниц, которые были очищены непосредственно перед использованием. Поместите кусочки мембраны на алюминиевую фольгу и добавьте от 2 до 5 микролитров этанола к каждому кусочку. Прежде чем мембраны полностью высохнут, добавьте от 2 до 5 микролитров белкового элюанта на каждый кусочек и высушите их на воздухе, пока поверхность мембраны не станет матовой.

Затем переложите мембраны в 1,5-миллилитровые пробирки и храните их при температуре 4 градуса Цельсия. Если вы используете сразу, добавьте от 2 до 30 микролитров этанола, что сделает их гидрофильными. Удалите этанол с помощью пипетки. Но прежде чем мембраны высохнут, полностью добавьте в каждую пробирку по 200 микролитров реакционного раствора на основе DTT, и инкубируйте их при температуре 56 градусов Цельсия в течение одного часа.

После инкубации замените реакционный раствор 300 микролитрами раствора йодоацетамида, и инкубируйте в темноте в течение 45 минут. Затем дважды промойте мембраны дистиллированной водой, а один раз 2% ацетонитрилом путем вортексирования в течение не менее 10 секунд.

Работа с дитиотреитолом и ацетонитрилом может быть крайне опасной. При проведении процедуры пищеварения на мембране всегда следует надевать маску, очки и перчатки.

Приготовьте трипсин в соответствии с указаниями в рукописи и добавьте по 100 микролитров раствора для реакции трипсина на каждую мембрану. Выдерживайте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия для пищеварения.

На следующий день переложите реакционный раствор в чистую 1,5-миллилитровую пробирку, и добавьте на мембрану 100 микролитров промытых растворов. Инкубируйте мембрану при температуре 60 градусов Цельсия в течение двух часов.

Затем соберите промытый раствор и смешайте его с реакционным раствором. Добавьте к мембране еще 100 микролитров промытого раствора, и обрабатывайте его ультразвуком в течение 10 минут. Затем соберите промытый раствор и смешайте его с реакционным раствором. Накройте пробирку кусочком лабораторной пленки, а иглой проделайте в пленке небольшие отверстия.

Высушите раствор с помощью вакуумного концентратора, а остаток растворите в 10 микролитрах 0,2% муравьиной кислоты. Центрифугируйте пробирку при давлении 12 000 x g в течение трех минут и перенесите надосадочную жидкость в пробирку для образца.

Проанализируйте образец с помощью масс-спектрометра, подключенного к системе ВЭЖХ с нано-LC

.