Расщепление белков на мембране для получения ко-иммунопреципитированных белков для исследований взаимодействия

Для выполнения мембранного расщепления принимают раствор ко-иммунопреципитированных белковых комплексов, каждый из которых содержит рекомбинантный GFP-меченый целевой белок, связанный с его партнерским белком.

Перенесите белки в пробирку, содержащую предварительно увлажненный поливинилидендифторид, мембрану из ПВДФ, и инкубируйте. Гидрофильная поверхность мембраны PVDF помогает переносу белков на мембрану.

Перенесите белоксодержащую мембрану в свежую пробирку. Добавьте буфер, содержащий восстановитель, чтобы уменьшить дисульфидные связи между остатками цистеина, что приводит к денатурации отдельных белков в комплексах без нарушения их взаимодействия.

Замените этот раствор алкилирующим реагентом, который алкилирует сульфгидрильную группу обоих белков в комплексах и препятствует образованию дисульфидных связей. Промойте мембрану, чтобы удалить излишки реагента.

Обработайте мембрану буфером, содержащим трипсин — протеолитический фермент. Трипсин расщепляет целевой белок, меченный GFP, и его партнерский белок на карбоксильных окончаниях остатков аргинина и лизина, высвобождая более мелкие пептиды в надосадочную жидкость. Переложите надосадочную жидкость в свежую трубку.

Промойте мембра