Why does baseline measurement matter in BLI?

Establishing a stable baseline interferometric response before ligand loading ensures accurate detection of subsequent wavelength shifts during binding events, which is critical for reliable kinetic analysis and target validation decisions.

How does ligand immobilization affect analyte binding detection?

Immobilizing histidine-tagged ligands via Ni-NTA chemistry creates a stable binding surface, allowing analyte binding to be detected as increases in optical thickness and wavelength shift, enabling quantitative interaction measurement.

What does wavelength shift indicate during association and dissociation?

Wavelength shifts during association reflect ligand-analyte binding, while shifts during dissociation reveal complex stability; together, they provide kinetic data essential for assessing target engagement and lead quality.

Why are defined incubation times important in BLI workflows?

Using minimum durations (e.g., 30 seconds for baseline, 120 seconds for association/dissociation) ensures sufficient time for binding equilibrium and dissociation monitoring, improving data reproducibility and cross-team comparability.

What software capabilities are needed to analyze BLI data?

The associated software must record real-time interference patterns, calculate wavelength shifts over time, and generate sensorgrams for kinetic analysis (kon, koff, KD), enabling data-driven decisions in lead identification and target validation.

Технология биослойной интерферометрии для обнаружения взаимодействий между лигандом и аналитом

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

0 views • 5:13 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для детектирования лиганд-аналитных взаимодействий с помощью биослойной интерферометрии (BLI) начинают с гидратированного волоконно-оптического биосенсора, закрепленного на креплении BLI, настроенного на нужную программу.

Наконечник биосенсора покрыт биосовместимым слоем, иммобилизованным никель-нитрилотриуксусной кислотой, Ni-NTA, группами. Погрузите наконечник биосенсора в буфер

Прибор излучает белый свет в направлении биосенсора, который отражается от двух интерфейсов: внутреннего опорного или оптического слоя и биосовместимого слоя. Отраженные лучи интерферируют конструктивно или разрушающе на разных длинах световых волн. Фотоприемник обнаруживает результирующую интерференционную картину.

После исходного измерения интерферометрического ответа добавьте раствор лиганда, меченный гистидином. Метки гистидина связываются с катионами никеля на биосенсоре, иммобилизуя лиганды на наконечнике.

В результате ассоциации излучаемый белый свет отражается от оптического слоя, а биосовместимый слой иммобилизуется лигандами с увеличенной оптической толщиной на конце. Это увеличивает расстояние между отражающими слоями, вызывая сдвиг интерференционной картины и сдвиг длины волны.

Промойте наконечник, удалив несвязанные лиганды. Инкубируйте с раствором целевого аналита. Аналит связывается с лигандом, еще больше увеличивая оптическую толщину на конце, вызывая увеличенный сдвиг длины волны.

Поместите наконечник биосенсора в буфер. Запишите сдвиг длины волны во время диссоциации аналита с лиганда, иммобилизованного на кончике.

Мониторинг изменения сдвига длины волны с течением времени облегчает изучение молекулярных взаимодействий между лигандами и аналитами.

Включите автомат BLItz. Убедитесь, что аппарат подключен к компьютеру через USB-порт вывода данных на задней панели аппарата.

На компьютере откройте соответствующее программное обеспечение и нажмите «Расширенная кинетика» в левой части экрана. В программном обеспечении введите всю необходимую информацию об эксперименте под каждым соответствующим заголовком. Нажмите на «Тип биосенсора» и выберите «Ni-NTA» в раскрывающемся меню. Продолжительность каждого шага может быть изменена с По умолчанию по мере необходимости. Для получения оптимальных результатов используйте минимум 30 секунд для начального базового уровня и базового уровня и 120 секунд для ассоциации и диссоциации.

Извлеките гидратированный никель-NTA-биосенсор из ПЦР-пробирки и прикрепите его к креплению биосенсора на аппарате, сдвинув широкую часть биосенсора на крепление.

Поместите черную микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитра в держатель пробирки аппарата и нанесите в нее 400 микролитров буфера LI. Закройте крышку аппарата так, чтобы наконечник биосенсора погрузился в буфер в микроцентрифужной пробирке. Нажмите «Далее» в программном обеспечении, чтобы начать запись исходного базового уровня.

После завершения записи на начальном этапе базовой версии откройте крышку устройства. Переместите ползунок вправо. Нанесите 4 микролитра диализованного лиганда на держатель и закройте крышку аппарата, после чего автоматически начнется запись этапа загрузки.

После завершения записи на этапе загрузки откройте крышку устройства. Переместите ползунок влево так, чтобы держатель трубки снова оказался перед черной стрелкой. Закройте крышку аппарата и убедитесь, что наконечник биосенсора погружен в буфер BLI пробирки в держателе пробирки. Аппарат и программное обеспечение автоматически начнут запись базового этапа.

После того как запись будет завершена на этапе базового уровня, откройте крышку устройства. Снимите держатель капель и очистите его, отпив все белки и промыв его дважды деионизированной водой в общей сложности пять раз. С помощью салфетки очистите поверхность держателя капель после последней стирки. Установите откидной держатель обратно на устройство. Переместите ползунок на машине вправо так, чтобы держатель сбрасывателя снова оказался перед черной стрелкой.

Нанесите пипетку объемом 4 микролитра диализованного аналита на держатель и закройте крышку аппарата, что автоматически начнет запись шага ассоциации. После завершения записи на этапе ассоциации откройте крышку устройства. Переместите ползунок на аппарате вправо так, чтобы держатель трубки снова оказался перед черной стрелкой, и закройте крышку аппарата, которая автоматически начнет запись этапа диссоциации.