Иммунопреципитация для изучения взаимодействия ферментных рецепторов в трансфицированных клетках

Запрограммированная смерть-1, PD-1, рецепторный белок клеточной поверхности, содержит два цитоплазматических тирозиновых мотива — ингибирующий мотив, ITIM, и переключательный мотив, ITSM. Связывание лиганда индуцирует фосфорилирование ITIM и ITSM и рекрутирование белка тирозинфосфатазы SHP2 в цитоплазматический домен PD-1, запуская нисходящий сигнальный каскад.

Для изучения взаимодействий SHP2-PD-1 с помощью коиммунопреципитационного анализа получают адгезивную культуру эпителиальных клеток. Эти клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок, меченный GFP PD-1 дикого типа с фосфорилированными ITIM и ITSM. Получить эпителиальные клетки, экспрессирующие GFP-меченый мутантный PD-1, при этом мутации ITIM или ITSM ингибируют их фосфорилирование.

Добавьте буфер для лизиса, содержащий моющее средство и ортвованадат натрия. Детергенты лизируют клетки, вызывая высвобождение белка PD-1, меченного GFP. Ортованадат натрия блокирует высвобождаемые фосфатазы, тем самым предотвращая дефосфорилирование ITIM и ITSM.

Центрифугируйте лизат. Переложите содержащую белки надосадочную жидкость в свежие пробирки. Добавьте агарозные шарики, покрытые покрытием из антител к GFP. Белки PD-1, меченные GFP, связываются с антителами против GFP.

Инкубируйте с суспензией SHP2. PD-1-GFP, связанный с гранулами, связывается с SHP2 через фосфорилированные ITIM и ITSM.

Добавьте буфер Laemmli и вскипятите, чтобы восстановители и моющие средства в буфере денатурировали белковые комплексы PD-1-GFP-SHP2. Центрифугируйте и соберите надосадочную жидкость, содержащую денатурированные белковые комплексы. Выполните SDS-PAGE и вестерн-блот.

PD-1 дикого типа и мутация ITIM взаимодействуют с SHP2. Мутанты ITSM не связываются с SHP2, что указывает на то, что взаимодействие PD1-SHP2 требует фосфорилированного ITSM.

Во время выполнения иммунопреципитации все действия следует выполнять либо на льду, либо при температуре 4 градуса Цельсия. Дополните буфер для лизиса ингибиторами протеазы, растворив одну таблетку ингибиторов в 10 миллилитрах буфера. Кроме того, добавьте 1 миллимоляр ортованадата натрия в буфер, который будет использоваться на трансфицированных планшетах PD1-GFP. Добавьте 500 микролитров ледяного буфера для лизиса в клетки, обязательно добавляя буфер для лизиса, содержащий ортванадат натрия, только в пластины, содержащие трансфицированные клетки PD1-GFP.

С помощью скребка для клеток немедленно удалите и соберите клетки с пластин. Переложите лизаты в холодные пробирки объемом 1,5 миллилитра и вращайте их в 0,005 раза больше g и при 4 градусах Цельсия в течение 30 минут. Чтобы собрать постядерную надосадочную жидкость из лизатов, вращайте их при температуре 10 000 g и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут.

Переложите надосадочную жидкость в новые пробирки и выбросьте гранулы. Храните надосадочную жидкость для второго набора из шести планшетов на льду для последующего анализа WCL.

Чтобы начать приготовление бусин против GFP, осторожно встряхните бутылку с бусинами перед открытием, чтобы предотвратить их оседание. Удалите 40 микролитров гранул, препятствующих GFP, из суспензии в соответствии с каждым условием. Центрифугируйте при 500 умноженных на g и 4 градусах Цельсия в течение 3 минут. Удалите надосадочную жидкость для мытья шариков, стараясь свести к минимуму контакт между пипеткой и шариками, чтобы предотвратить потерю.

Ресуспендируйте гранулы в 80 микролитрах буфера для лизиса на образец. Добавьте промытые шарики непосредственно в лизат клеток из PD1-GFP-экспрессирующих клеток первого набора из четырех пластин. Вращайте со скоростью 0,005 г в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия, чтобы иммунопреципитировать белки, меченные GFP. Промойте бусины три раза, используя 1 миллилитр холодного буфера для лизиса, не содержащего ортованадат, для каждой промывки. Затем центрифугируйте при перегрузке в 2500 раз больше g в течение 10 секунд.

Разделите лизат активного SHP2 из первого набора пластин на три равные части и добавьте по порции в каждую из трех пробирок, содержащих промытые гранулы, содержащие PD1-GFP. Добавьте 1/3 объема лизата из нетрансфицированных клеток во вторую пробирку гранул PD1-GFP дикого типа. Отбросьте оставшиеся 2/3.

Выминайте бусины в течение 4 часов при температуре 4 градуса Цельсия с мягким вращением в 0,005 раза г. После этого промойте бусины дважды, используя 1 миллилитр буфера для холодного лизиса на каждую промывку. Добавьте 80 микролитров буфера для лизиса в каждый образец, следя за тем, чтобы общий объем в каждой пробирке составлял 100 микролитров. С помощью отрезанного кончика пипетки аккуратно перемешивайте пипетку вверх и вниз. Затем перелейте по 50 микролитров из каждой пробирки в две свежие 1,5-миллилитровые пробирки.

Сначала уменьшите количество шариков при 2000 g и 4 градусах Цельсия в течение 30 секунд и удалите надосадочную жидкость. Добавьте 20 микролитров 2x Laemmli buffer и варите при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. С помощью набора BCA измерьте концентрацию белка входного контроля.

Переложите 30 микролитров максимально разбавленной пробы в новую пробирку. Используйте буфер для лизиса, чтобы разбавить остальные входные элементы управления до той же концентрации, что и наиболее разбавленный образец. Затем переложите по 30 микролитров каждого из разбавленных входных регуляторов в новую пробирку. Добавьте к лизатам равные объемы 2x Laemmli buffer и варите их при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.

После этого уменьшите количество шариков при 2000 g и 4 градусах Цельсия в течение 30 секунд, прежде чем выполнять анализ вестерн-блоттинга, как описано в текстовом протоколе.