Иммунопреципитация для изучения взаимодействия ферментных рецепторов в трансфицированных клетках

Запрограммированная смерть-1, PD-1, рецепторный белок клеточной поверхности, содержит два цитоплазматических тирозиновых мотива — ингибирующий мотив, ITIM, и переключательный мотив, ITSM. Связывание лиганда индуцирует фосфорилирование ITIM и ITSM и рекрутирование белка тирозинфосфатазы SHP2 в цитоплазматический домен PD-1, запуская нисходящий сигнальный каскад.

Для изучения взаимодействий SHP2-PD-1 с помощью коиммунопреципитационного анализа получают адгезивную культуру эпителиальных клеток. Эти клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок, меченный GFP PD-1 дикого типа с фосфорилированными ITIM и ITSM. Получить эпителиальные клетки, экспрессирующие GFP-меченый мутантный PD-1, при этом мутации ITIM или ITSM ингибируют их фосфорилирование.

Добавьте буфер для лизиса, содержащий моющее средство и ортвованадат натрия. Детергенты лизируют клетки, вызывая высвобождение белка PD-1, меченного GFP. Ортованадат натрия блокирует высвобождаемые фосфатазы, тем самым предотвращая дефосфорилирование ITIM и ITSM.

Центрифугируйте лизат. Переложите содержащую белки надосадочную жидкость в свежие пробирки. Добавьте агарозные шарики, покрытые покрытием из антител к GFP. Белки PD-1, меченные GFP,