Биотинилированный пептидный зонд, проникающий в клетку, для обнаружения белок-белковых взаимодействий

В клетках белки связываются с взаимодействующими белками через определенные последовательности в своей структуре, модулируя функционирование внутриклеточных белков.

Чтобы обнаружить внутриклеточные белковые взаимодействия, берут адгезную культуру клеток. Отсасывайте среду.

Добавьте биотинилированный пептид, проникающий в клетки, раствор BCPP и инкубируйте.

Каждый BCPP содержит пептидную последовательность, которая помогает в специфическом связывании с целевым внутриклеточным белком. Пептид имеет проникающий в клетки пептид, CPP, на N-конце пептида и биотин на C-конце для легкого обнаружения.

Во время инкубации положительно заряженная область CPP способствует проникновению связанного пептида через клеточную мембрану, достигая цитоплазмы. Пептид связывается со своим внутриклеточным взаимодействующим белковым партнером, образуя белковый комплекс BCPP-мишень.

Добавьте буфер, содержащий молекулы детергента, которые разрывают клеточную мембрану и высвобождают белковые комплексы-мишени BCPP и другие клеточные компоненты.

Добавьте раствор авидина, связанного с агарозными шариками, — гликопротеина, который специфически связывается с биотином в BCPP. Инкубируйте, обеспечивая необратимое связывание авидина с биотином и очищая белковые комплексы авидин-BCPP-мишень.

Центрифуга для гранулирования шариков. Ресуспендируйте гранулы в буфере, чтобы расщепить нековалентные связи между белками и элюировать СРФ-пептид-белковые комплексы из гранул биотин-авидин.

Анализируйте комплексы СРФ-пептид-белок методом вестерн-блоттинга. Более высокая молекулярная масса комплекса CPP-пептид-белок, чем у компонентов комплекса, указывает на успешное взаимодействие между взаимодействующими белковыми партнерами.

Добавьте объем стокового раствора БКФЗ к культурам клеток, чтобы достичь концентрации, эффективность которой была доказана.

Поэтому добавьте 92,8 мкл 2 мг на миллилитр ТАТ-Коннексина-43_{266-283-Биотина} на миллилитр питательной среды. Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на 30 минут, чтобы убедиться в том, что взаимодействие между BCPP и его внутриклеточными партнерами происходит.

Чтобы провести экстракцию белка, сначала полностью аспирируйте питательную среду. Затем промойте клетки 10 миллилитрами ледяного фосфатно-солевого буфера на 150 сантиметров, очень осторожно, чтобы избежать отслоения клеток.

Чтобы получить лизат клеток, добавьте 3 миллилитра буфера для лизиса на колбу площадью 150 квадратных сантиметров и тщательно соскребите поверхность с помощью скребка для клеток. Наклон колбы примерно на 45 градусов облегчит сбор лизатов клеток в соответствующие пробирки.

Налейте 1 миллилитр клеточного лизата на пробирку в 3 пробирки по 1,5 миллилитров, помеченных по условиям. Для вытягивания центрифугируйте 1,5-миллилитровые пробирки при давлении 11 000 x g в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия.

Перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки с маркировкой А. Перенесите аликвоту надосадочной жидкости по состоянию в другие пробирки с маркировкой В. Затем добавьте 16,6 микролитров 4x Laemmli buffer на 50 микролитров лизата и заморозьте при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Затем очень хорошо гомогенизируйте агарозу NeutrAvidin путем легкого встряхивания.

Обрежьте кончики наконечников пипеток, чтобы увеличить их диаметр и улучшить пипетирование шариков. Затем добавьте 50 микролитров агарозы NeutrAvidin на миллилитр клеточного лизата в пробирках А. Инкубируйте клеточные лизаты при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи с очень легким встряхиванием, чтобы позволить нейтравидину взаимодействовать с BCPP, связанными с их внутриклеточными партнерами.

Затем центрифугируйте при 3000 умноженных на g в течение 1 минуты при 4% градусах Цельсия, чтобы собрать комплекс NeutrAvidin с белками. Осторожно извлеките надосадочную жидкость и переложите их в чистые пробирки с маркировкой C. Оставьте их для использования на случай, если вытягивание не удастся.

Чтобы промыть комплекс NeutrAvidin с белками, добавьте в гранулы А-туб свежий буфер для лизиса. Повторно суспендируйте гранулу путем инверсии и повторите центрифугирование. Повторите эту стирку еще пять раз. От всех этих надосадочных пластов можно отказаться.

Далее добавьте 40 микролитров 2x буфера Laemmli на 1,5-миллилитровую пробирку для гранул, полученных из колб 150 квадратных сантиметров сливающихся клеток. Затем вынимайте при температуре 100 градусов Цельсия в течение 5 минут, чтобы диссоциировать взаимодействия между белками.

После элюирования центрифугируйте в течение 30 секунд при 8 200 g для гранулирования гранул NeutrAvidin. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую диссоциированные белки с капиллярными концами, в новые пробирки, помеченные D.

Теперь эти надосадочные жидкости готовы к загрузке в вестерн-блоттинг, как описано в текстовом протоколе, или они могут быть заморожены при температуре минус 20 градусов по Цельсию.