Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 5:20 мин. • July 8th, 2025
Для двухгибридного анализа дрожжей возьмем генетически модифицированную, активно растущую суспензию дрожжевых клеток, в которой отсутствует белок-активатор транскрипции GAL4. Эти клетки не могут синтезировать лейцин и триптофан.
Добавьте пару экспрессирующих плазмид: одна, кодирующая лейцин и ДНК-связывающий домен, DNA-BD, GAL4, слилась с доменом белка-мишени, а другая, кодирующая триптофан и активаторный домен, AD, GAL4, слилась с другим доменом белка-мишени.
Добавьте буфер, содержащий подходящие агенты для преобразования. Подвергайте клетки тепловому шоку, вызывая временное образование пор, способствуя усвоению клеточной плазмиды. Остудите, чтобы снова запечатать поры. Поместите клетки на селективную питательную среду, в которой отсутствуют лейцин и триптофан.
Трансформированные клетки, экспрессирующие два гибридных белка, синтезируют лейцин и триптофан, выживают и образуют колонии.
ДНК-BD, слитая с белковым доменом, связывается со специфической восходящей последовательностью ДНК промоторной области гена β-галактозидазы. Если домены белка-мишени взаимодействуют, AD и ДНК-BD сближаются, вызывая восстановление функционального GAL4, что приводит к экспрессии гена β-галактозидазы.
Пе
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео