Тандемный аффинный анализ очистки для изучения белок-белковых взаимодействий

Тандемная аффинная очистка — это последовательная схема очистки для выделения белковых комплексов из клеток для изучения белок-белковых взаимодействий.

Для начала возьмем культуру клеток, экспрессирующую интересующие вас белки, помеченные эпитопами. Белки образуют комплекс внутри клетки. Один из белков в комплексе содержит стрептококковую метку, в то время как другой помечен FLAG-меткой. Это небольшие синтетические пептидные метки на основе аффинных последовательностей.

Удалите среду и добавьте раствор моющего средства, чтобы лизировать клетки. Центрифуга для удаления клеточного мусора. Соберите надосадочную жидкость, содержащую целевой белковый комплекс и другие клеточные белки.

Добавьте стрептококк — агарозные бусины, покрытые стрептавидином — и инкубируйте. Стрептококковая метка белкового комплекса связывается со стрептавидином. Центрифуга для сбора белковых сложных гранул. Промойте, чтобы удалить любые загрязняющие клеточные белки.

Добавьте элюирующий буфер, содержащий дестиобиотин — производное биотина, который вытесняет белковый комплекс путем конкурентного связывания со стрептавидином. Центрифуга для получения надосадочной жидкости, содержащей элюированный белковый комплекс.

Добавьте FLAG-бусины — агарозные бусины, покрытые антителами против FLAG, — и инкубируйте. FLAG-метка белкового комплекса связывается с антителом. Центрифуга для сбора белковых сложных гранул.

Добавьте элюирующий буфер, содержащий свободный пептид FLAG. Пептид конкурентно связывается с антителом и вытесняет связанный белковый комплекс. Центрифуга для элюирования очищенного белкового комплекса.

Оцените присутствие обоих белков в элюте, чтобы подтвердить взаимодействие между представляющими интерес белками.

После того как клеточный лизат и суспензионные смеси STREP-гранул инкубируются в течение 2 часов, раскрутите их в 11500 раз больше g в течение 2 минут при 4 градусах Цельсия. Сохраните надосадочную жидкость как «STREP AP flow-through» и храните при температуре 4 градуса Цельсия.

Добавьте в бусины 500 микролитров STREP AP Wash Buffer 1. Измельчите шарики и буферную смесь в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия и центрифугируйте при 1500 г в течение 2 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и снова промойте 500 микролитрами STREP AP Wash Buffer 1.

После третьей промывки переложите раствор в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, чтобы снизить белковый фон. Промойте четвертый раз с помощью буфера для стирки STREP AP 1. После отжима удалите надосадочную жидкость, и добавьте 500 микролитров Wash Buffer 2.

Уравновесьте бусины, перевернув трубки, а затем вращайте вниз со скоростью 1500 g в течение 2 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость. Разбавьте интересующий белок 50 микролитрами STREP-элюирующего буфера. Вихрь при 800 об/мин в течение 15 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Крутите бусины при 1500 умноженных на g в течение 1 минуты при температуре 4 градуса Цельсия. Соберите надосадочную жидкость. Эта фракция соответствует образцу «STREP AP элюирование».

Оставьте фракцию бусин при 4 градусах Цельсия для повторного вымывания. Аликвота 10% элюирования STREP AP для окрашивания серебром и/или вестерн-блоттинга.

Чтобы увеличить количество исходного материала для последующей иммунопреципитации FLAG, первый и второй элюции STREP могут быть объединены вместе для более эффективного восстановления элюирования FLAG.

Начните эту процедуру с помощью наконечника пипетки с широким горлышком, чтобы перенести соответствующее количество раствора FLAG в микроцентрифужную пробирку. Вращайте при 1 500 умноженных на g в течение 2 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и добавьте в шарики 500 микролитров FLAG Wash Buffer.

Вращайте при 1 500 умноженных на g в течение 2 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и снова промойте с помощью буфера для стирки FLAG. После третьей промывки удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте шарики в буфере для промывки FLAG до конечного объема n умножить на 16 микролитров, где n — количество образцов.

Добавьте 16 микролитров суспензии для гранул FLAG к оставшемуся элюированию STREP AP и наденьте на ночь при температуре 4 градуса Цельсия. После ночной инкубации суспензии гранул FLAG и элюирования STREP AP продолжайте иммунопреципитацию FLAG.

Вращайте подвеску бусин FLAG при 1500 умноженных на g в течение 2 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Сохраните надосадочную жидкость в виде проточной жидкости FLAG IP и храните при температуре 4 градуса Цельсия.

Добавьте в бусины 500 микролитров буфера для стирки FLAG. Наденьте в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия и центрифугируйте при 1500 умноженных на г в течение 2 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и снова промойте 500 микролитрами буфера для стирки FLAG.

После третьей промывки перелейте раствор белковых шариков в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку для уменьшения фона. Промойте в четвертый раз с помощью буфера для стирки FLAG. Снимите надосадочную жидкость с конечного отжима, и добавьте в бусины 30 микролитров промывочного буфера FLAG, содержащего 200 нанограмм на микролитр пептида FLAG. Вихрь при 800 об/мин в течение двух часов при температуре 4 градуса Цельсия.

Через два часа уменьшите вес при 1500 g в течение 2 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Соберите надосадочную жидкость и храните при температуре 4 градуса Цельсия в качестве «элюирования FLAG IP».