Тандемный аффинный анализ очистки для изучения белок-белковых взаимодействий

Тандемная аффинная очистка — это последовательная схема очистки для выделения белковых комплексов из клеток для изучения белок-белковых взаимодействий.

Для начала возьмем культуру клеток, экспрессирующую интересующие вас белки, помеченные эпитопами. Белки образуют комплекс внутри клетки. Один из белков в комплексе содержит стрептококковую метку, в то время как другой помечен FLAG-меткой. Это небольшие синтетические пептидные метки на основе аффинных последовательностей.

Удалите среду и добавьте раствор моющего средства, чтобы лизировать клетки. Центрифуга для удаления клеточного мусора. Соберите надосадочную жидкость, содержащую целевой белковый комплекс и другие клеточные белки.

Добавьте стрептококк — агарозные бусины, покрытые стрептавидином — и инкубируйте. Стрептококковая метка белкового комплекса связывается со стрептавидином. Центрифуга для сбора белковых сложных гранул. Промойте, чтобы удалить любые загрязняющие клеточные белки.

Добавьте элюирующий буфер, содержащий дестиобиотин — производное биотина, который вытесняет белковый комплекс путем конкурентного связывания со стрептавидином. Центрифуга для получения надосадочной жидкости, содержащей элюированный белковый комплекс.