JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 6:05 мин • July 8th, 2025
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса, или ЯМР, позволяет обнаруживать белок-белковое взаимодействие на атомном уровне.
Чтобы изучить взаимодействие между глобулярными и спиральными белками, пометьте очищенные белки дикого типа или мутантные глобулярные белки 15N — изотопом азота. В ЯМР-пробирке смешайте меченые глобулярные и немеченые спиральные белки в растворителе, содержащем стандарт ЯМР. Вставьте трубку в ЯМР-спектрометр.
Магниты спектрометра генерируют сильное магнитное поле, выравнивая 15N-меченых ядер глобулярных белков параллельно полю. Радиочастотный, или РЧ, импульс возбуждает 15N-ядер, чтобы они выровнялись антипараллельно полю.
Частота импульсов, необходимая для перехода 15N ядер между двумя состояниями, определяет резонансную частоту. Нормализация резонансной частоты 15N-резонанса до стандарта ЯМР измеряет химический сдвиг 15N.
Магнитное поле настраивается таким образом, чтобы выровнять 1H-ядра, связанные с 15Н, параллельно полю. Радиочастотные импульсы корректируются, и регистрируется химический сдвиг на 1H.
Во время взаимодействия белков химическая среда, окружающая взаимодействующие аминокислотные остатки, изменяется, изменяя 15химических связей N-1H и соответствующие химические сдвиги. Построение графика спектров ЯМР 15 N-1H.
Без спиральных белков глобулярные белки дикого типа демонстрируют хорошо разрешенные спектральные пики. При взаимодействии спиральных и глобулярных белков дикого типа спектральный пик уменьшается. Напротив, инкубация спиральных белков с мутантными глобулярными белками приводит к повторному появлению спектральных пиков, что указывает на отсутствие взаимодействия между ними.
Включите обдув с помощью команды «ej». Это поднимет образец вверх от магнита. Теперь поместите образец в спиннер поверх магнита в отверстии. Вставьте с помощью команды "ij". Подождите, пока образец остановится внутри магнита, прежде чем продолжить.
Создайте новый набор данных с помощью команды "edc" и загрузите параметры Стандартного протонного ЯМР, выбрав эксперимент "ZGPR". Заполните поля с названием, номером эксперимента и номером папки с обработанными данными.
Выберите растворитель в поле "Set Solvent" и нажмите "Execute 'getprosol'", чтобы прочитать стандартную головку зонда и параметры, зависящие от растворителя. Заблокируйте образец на дейтерированном растворителе с помощью команды «Блокировка» и подождите, пока он не завершит очистку и не достигнет блокировки.
Скорректируйте резонансную частоту магнита, настроив образец с помощью команды автоматической настройки "atma". Следите за кривой колебания до тех пор, пока автоматическая настройка не будет завершена.
Прокладка магнитного поля с помощью «ТОПШИМ». Шимминг выполняет регулировку магнитного поля для достижения однородности вокруг образца. Хорошей практикой является сохранение тех же значений с помощью команды "wsh" и чтение их с помощью "rsh" перед topshim, если вы используете те же или похожие примеры.
Теперь отрегулируйте усиление приемника с помощью команды "rga", чтобы добиться максимального отношения сигнал/шум. Поместите центр спектра на смещение резонанса воды и установите 90-градусный протонный импульс на высокую мощность с помощью "calibo1p1".
Соберите протонный спектр с помощью команды Zero Go "zg" и обработайте с помощью "efp". Это включает в себя экспоненциальное умножение, затухание свободной индукции с учетом уширения линии, преобразование Фурье FID и «pk» для применения фазовой коррекции.
Примените автоматическую фазовую коррекцию "apk" и автоматическую базовую коррекцию "absn" с помощью полинома без интегрирования. Создайте новый набор данных для эксперимента SOFAST HMBC, выбрав «SFHMQC3GPPH» в эксперименте.
Скопируйте оптимизированные P1 и O1 из протонного спектра и заполните P1-зависимые импульсы с помощью команды "getprosol 1H p1 plw1", где P1 — оптимизированное значение P1, а plw1 — уровень мощности для P1. Теперь оптимизируйте константу CNST54, чтобы задать смещение для химического сдвига амида. Кроме того, оптимизируйте CNST55 для определения ширины полосы частоты, чтобы охватить спектральные области интереса, что позволит оптимизировать усиление приемника.
Чтобы выбрать эти параметры, извлеките первый FID из двумерного спектра и найдите наблюдаемый сигнал для их определения. Кроме того, изменяйте задержку релаксации, количество сканирований и фиктивных сканирований для получения приемлемой чувствительности сигнала с помощью команды «gs», которая позволяет выполнять сканирование для мониторинга качества данных в режиме реального времени. Наконец, запишите спектры с помощью Zero Go "zg".