Использование фагового дисплея для выбора белков с высоким сродством к белку-мишени

Начните фаговый дисплей с добавления библиотеки фагов в лунки многолуночного планшета, покрытого белком-мишенью. Библиотека фагов содержит генетически модифицированные фаги, каждый из которых отображает отдельный вариант белка, слитый с белком оболочки на его поверхности. Инкубируйте, позволяя фагу и белкам-мишеням взаимодействовать.

Фаги с белками с высоким сродством к белку-мишени связываются с белком-мишенью. Промойте буфером, удаляя несвязанные фаги. Добавьте кислый раствор, нарушая взаимодействие фагов и целевых белков, высвобождая фаги в раствор. Нейтрализуйте pH раствора с помощью буфера, поддерживая стабильность фагов.

Перенесите фаги в свежую пробирку. Инкубируйте с блокирующим раствором, содержащим белки, предотвращающие неспецифические взаимодействия.

Перенесите фаги в активно делящуюся суспензию кишечной палочки, заражающую бактерии и инициирующую цикл репликации фагов. Дополните вспомогательными фагами, которые заражают бактерии, обеспечивая белки оболочки, необходимые для упаковки потомства фагов. Перенесите суспензию в селективную среду, позволяя размножаться инфицированным фагами бактериям.

Фаги потомства в конечном итоге высвобождаются в среду. Центрифуга. Соберите надосадочную жидкость, содержащую фаги. Добавьте раствор осадка, концентрируя фаговые частицы. Центрифуга. Ресуспендируйте фаговую гранулу в буфере, получив однородную суспензию.

Выполните последующие раунды отбора фагов; повторите связывание фаг-мишени с белком-мишенью, элюирование с увеличенной стадией промывки буфера, а также этапы амплификации и центрифугирования, что приведет к обогащению фаговых пулов, отображающих белки с высоким сродством к белку-мишени.

Разморозьте библиотеку фагов на льду. Затем уменьшите его до 100 раз по сравнению с библиотечным разнообразием в PBS. Добавьте раствор полиэтиленгликоля/хлорида натрия на 1/5 объема разбавленной библиотеки и инкубируйте раствор на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируйте раствор при 11 000 умноженных на g в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и центрифугируйте ее еще две минуты, чтобы удалить оставшуюся надосадочную жидкость и сконцентрировать фаговую гранулу.

Осторожно повторно суспендируйте фаговую гранулу в одном миллилитре буфера PBT на каждый анализируемый целевой белок, как правило, четыре в общей сложности. Добавьте по 100 микролитров фаговой библиотеки в каждую лунку, покрытую покрытием в контрольной пластине. Инкубируйте его при комнатной температуре в течение часа с орбитальным встряхиванием со скоростью 300 об/мин.

Выбросьте буфер PB с целевой пластины в раковину и высушите тарелку на бумажных полотенцах. Перенесите все 100 микролитров фаговой библиотеки в контрольной пластине в каждую покрытую лунку целевой пластины. Инкубируйте его при комнатной температуре в течение часа с орбитальным встряхиванием со скоростью 300 об/мин.

Далее извлеките фаговую библиотеку из пластины, и четыре раза промойте покрытые лунки PT-буфером. Переверните тарелку и постучите по бумажному полотенцу, чтобы удалить последние капли буфера. Добавьте 100 микролитров 0,1 молярной соляной кислоты в каждую лунку с покрытием, чтобы разбавить фаг. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 5 минут с орбитальным встряхиванием со скоростью 300 об/мин.

После этого нейтрализуйте рН, добавив 12,5 микролитров рН 11 одного моляра Трис гидрохлорида в каждую лунку с покрытием. Перенесите элюированный фаг из всех восьми лунок в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Пипеткой вверх и вниз во время перекачки сделайте растворы однородными, и отсасывайте всю жидкость из лунок. Добавьте 10% BSA к элюированному фагу, чтобы получить конечную концентрацию 1%.

Храните микроцентрифужную пробирку при температуре четыре градуса Цельсия. Это круглый выход. Подготовьте культуру семян для культивирования фагового ввода для следующего раунда отбора путем инокуляции пяти миллилитров культуры семян 2YT/Tetracycline с изолированной колонией E. coli из агаровой пластины.

Инкубируйте его в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с орбитальным встряхиванием со скоростью 200 об/мин. Разведите целевой белок во втором и третьем кругах с соответствующим количеством PBS. Возьмите половину содержимого второго и третьего турбов и покройте четыре лунки каждого целевого белка в 96-луночной связующей пластине для следующего раунда.

Затем используйте половину круглого выхода для инокуляции трех миллилитров ячеек средней логарифмической фазы. Инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут с орбитальным встряхиванием со скоростью 200 об/мин. Добавьте M13KO7 Helper Phage до конечной концентрации 10 миллиардов пфе на миллилитр. Снова инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа с орбитальным встряхиванием со скоростью 200 об/мин.

Через час перенесите все три миллилитра культуры в 30 миллилитров раствора 2YT/Карбенициллин/Канамицин. Выращивайте за ночь при температуре 37 градусов Цельсия с орбитальным встряхиванием со скоростью 200 об/мин.