Бимолекулярная флуоресцентная фотоактивируемая локализация с комплементационной связью

В своей активной форме ассоциированный с плазматической мембраной мономер Ras — гуаниновый нуклеотид-связывающий белок — рекрутирует Raf, неактивную протеинкиназу, которая связывается с Ras через свой Ras-связывающий домен.

Это связывание приводит к образованию функционального комплекса Ras-Raf, который запускает процесс передачи сигналов ниже по потоку.

Чтобы визуализировать внутриклеточное взаимодействие Ras-Raf, начните с суспензии генетически модифицированных клеток в предметном стекле с хорошей камерой. Эти клетки экспрессируют два нефлуоресцентных гибридных белка — один содержит Ras, связанный с половиной фотоактивируемого флуорофора через его N-концевой, а другой — Raf, слитый с другой половиной того же флуорофора на его С-конце.

Внутри клеток Ras-содержащие гибридные белки стыкуются с плазматической мембраной и взаимодействуют с Raf-содержащими гибридными белками, восстанавливая фрагменты флуоресцентного белка в полный фотоактивируемый флуорофор. Отсутствие связывания Ras и Raf удерживает две половины флуорофора разделенными.

Добавьте на предметное стекло фиксирующий реагент. Фиксирующие молекулы образуют перекрестные связи с белками и стабилизируют белковые комплексы.

Удал