Бимолекулярная флуоресцентная фотоактивируемая локализация с комплементационной связью

В своей активной форме ассоциированный с плазматической мембраной мономер Ras — гуаниновый нуклеотид-связывающий белок — рекрутирует Raf, неактивную протеинкиназу, которая связывается с Ras через свой Ras-связывающий домен.

Это связывание приводит к образованию функционального комплекса Ras-Raf, который запускает процесс передачи сигналов ниже по потоку.

Чтобы визуализировать внутриклеточное взаимодействие Ras-Raf, начните с суспензии генетически модифицированных клеток в предметном стекле с хорошей камерой. Эти клетки экспрессируют два нефлуоресцентных гибридных белка — один содержит Ras, связанный с половиной фотоактивируемого флуорофора через его N-концевой, а другой — Raf, слитый с другой половиной того же флуорофора на его С-конце.

Внутри клеток Ras-содержащие гибридные белки стыкуются с плазматической мембраной и взаимодействуют с Raf-содержащими гибридными белками, восстанавливая фрагменты флуоресцентного белка в полный фотоактивируемый флуорофор. Отсутствие связывания Ras и Raf удерживает две половины флуорофора разделенными.

Добавьте на предметное стекло фиксирующий реагент. Фиксирующие молекулы образуют перекрестные связи с белками и стабилизируют белковые комплексы.

Удалите фиксирующий реагент и добавьте буфер для визуализации. Поместите предметное стекло под флуоресцентный микроскоп, набор для фотоактивированной локализационной микроскопии, PALM. Осветите клетки высокоинтенсивным лазером, активирующим небольшое подмножество флуоресцентных молекул.

Изобразите случайно возникающую флуоресценцию, производимую каждым наноразмерным, помеченным флуорофором комплексом Ras-Raf, видимым в виде флуоресцентных точек с высоким разрешением.

Чтобы подготовить образец для визуализации, поместите примерно 5,5 х 10 4 стабильных экспрессионных клетки в лунку 8-луночного предметного стекла со стеклянным дном в 350 микролитрах фенола без красных ДМЭМ. Используйте свежий параформальдегид с глутаральдегидом для фиксации клеток, а после замены фиксатора на PBS или буфер для визуализации, сделайте вихревые 100-нанометровые частицы золота и добавьте 35 микролитров на лунку для отслеживания дрейфа стадии во время визуализации.

Подойдите к микроскопу и включите 405 и 561 нанометровые лазеры. Удерживая жалюзи закрытыми на этом этапе, убедитесь, что 561-нанометровое дихроичное зеркало и режекторный фильтр находятся на месте. Откройте программу для получения изображений.

Включите камеру EMCCD и дайте ей остыть, установите время экспозиции на 100 миллисекунд и усиление EMCCD на соответствующее значение. Добавьте погружное масло в объектив и закрепите образец на предметном столике микроскопа. Затем с помощью светлого поля или 561-нанометрового лазера сфокусируйте образец.

Для визуализации Ras и других мембранных белков используйте объектив TIRF с 60-кратным апохроматом и числовой апертурой 1,49 и установите микроскоп в конфигурацию TIRF.

Отрегулируйте возбуждающий лазер таким образом, чтобы он был смещен от центра при попадании в заднюю апертуру объектива TIRF, что приведет к отклонению лазера при достижении границы буфера покровного стекла. Продолжайте регулировать положение падения лазера до тех пор, пока не будет достигнут критический угол и лазер не отразится обратно.

Найдите ячейку для изображения с несколькими золотыми частицами в поле зрения. Затем установите область интереса, которая заключает в себе ячейку или ее область и частицы золота.

В случае, если достаточная активация уже происходит из-за высокого уровня экспрессии, начните сбор данных с выключенным 405-нанометровым лазером и включенным 561-нанометровым лазером. В противном случае включите 405-нанометровый лазер на самой низкой заводской мощности и постепенно увеличивайте ее, пока в кадре не будет десятки молекул или около того, что отдельные молекулы будут хорошо разделены.

По мере продолжения сбора данных постепенно увеличивайте мощность 405-нанометрового лазера, чтобы плотность пятна оставалась примерно постоянной. Продолжайте получение изображения до тех пор, пока высокая мощность 405 не начнет больше никаких событий активации.