Иммунопреципитация хроматина для идентификации сайтов-мишеней связывания белков на геномной ДНК

Чтобы идентифицировать сайты связывания целевого белка на ДНК, начните с клеток-предшественников олигодендроцитов, содержащих целевой белок, сшитый со специфическими последовательностями ДНК в хроматине.

Обработайте клетки лизисным буфером, содержащим ингибиторы протеазы. Буфер для лизиса лизирует клетки, в то время как ингибиторы инактивируют протеазы, сохраняя целостность комплексов белок-хроматин.

Ультразвуком обрабатывайте содержимое, чтобы разрезать комплексы на более мелкие фрагменты хроматина, при этом некоторые из них сохраняют целевой белок.

Центрифуга для гранулирования компонентов клетки и перенос надосадочной жидкости, содержащей фрагменты хроматина, в свежую пробирку. Инкубируйте с антителами-мишенями, которые специфически связываются с белком-мишенью на фрагментах хроматина.

Дополните пробирку магнитными шариками, покрытыми белком А, которые связываются с Fc-областью предварительно связанных антител. Применение магнитного поля для селективного осаждения связанных антителами белков-мишеней в комплексе с фрагментами хроматина.

Обрабатывайте грануловые комплексы буфером для элюирования с высоким содержанием соли, чтобы нарушить белок-хроматиновые взаимодействия и высвободить голую ДНК без ассоциированных белков.

Используйте органические растворители для извлечения ДНК. Добавьте буфер для амплификации и запустите полимеразную цепную реакцию для амплификации фрагментов ДНК. После амплификации проанализируйте последовательность ДНК.

Сравните последовательность амплифицированных продуктов с последовательностью геномной ДНК клетки. Найти участок с соответствием последовательности между фрагментом и геномной ДНК — коррелирует с сайтами связывания с белками.

После подсчета в гемоцитометре добавьте 20 000 очищенных OPC в 1 миллилитр среды для культивирования клеток OPC для реакции ChIP. Затем добавьте 27 микролитров 36,5% формальдегида комнатной температуры на 10 минут. Это позволит зафиксировать клетки.

Через 10 минут добавьте 50 микролитров 2,5 молярного глицина на неподвижные клетки на 5 минут при комнатной температуре. Добавление глицина остановит сшивание ДНК-белков. Затем промойте сшитые клетки 1 миллилитром буфера HBSS с коктейлем ингибиторов протеазы. Затем центрифугируйте ячейки в предварительно охлажденной центрифуге при 300-кратном g при 4 градусах Цельсия.

После сшивания очищенных ОПЦ сшитые клетки следует промыть с использованием ледяного раствора HBSS, а остальные этапы ChIP следует проводить при температуре 4 градуса. В противном случае антитело не сможет должным образом осаждать геномную ДНК.

Затем добавьте 25 микролитров буфера для полного лизиса в клеточную гранулу и оставьте на льду на 5 минут. Далее пипетка 75 микролитров ледяного буфера HBSS с коктейлем ингибиторов протеазы. Затем срежьте хроматин клеточного лизата в предварительно охлажденной ультразвуковой системе с пятью циклами по 30 секунд ON и 30 секунд OFF.

После сдвига хроматина центрифугируйте клеточный лизат в 14 000 умноженных на g в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия. По окончании центрифугирования соберите надосадочную жидкость. Затем разведите 100 микролитров сдвигаемого хроматина с равным объемом ледяного буфера ChIP с ингибитором протеазы.

Далее добавьте 1 микролитр анти-олиг2 антитела Rabbit к 180 микролитрам разведенного срезанного хроматина. Инкубируйте пробирки на вращающемся колесе в течение 16 часов при температуре 4 градуса Цельсия при 40 оборотах в минуту. Затем добавьте 10 микролитров предварительно промытых шариков, покрытых протеином А, в реакционную пробирку ChIP в холодном помещении. Снова инкубируйте трубки ChIP при температуре 4 градуса Цельсия еще 2 часа на вращающемся колесе.

Через 2 часа оставьте реакционную трубку ChIP на магнитной стойке на минуту. Затем промойте гранулу шарика 100 микролитрами четырех буферов для промывки каждый в течение 4 минут на вращающемся колесе при температуре 4 градуса Цельсия. Затем добавьте 200 микролитров элюирующего буфера в гранулу гранул. Инкубируйте реакционную пробирку при температуре 65 градусов Цельсия в течение 4 часов.

После того, как двухцепочечная ДНК денатурирована, дефосфорилируйте 3-прайм-конец одноцепочечной ДНК, добавив щелочную фосфатазу креветок. Затем добавьте поли(Т)-хвост к одноцепочечной ДНК с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы. Затем отжигают поли-(dA) праймер ДНК на одноцепочечную матрицу ДНК. Затем увеличьте библиотеку последовательностей ChIP с помощью прямых и обратных праймеров для индексации.

Количество циклов ПЦР для подготовки библиотеки зависит от количества исходной ДНК. Хорошая подготовка библиотеки требует точного количественного определения количества входной ДНК. Слишком большое или слишком малое количество циклов ПЦР может повлиять на концентрацию библиотеки, а также на ее сложность, что приведет к образованию артефактов ПЦР.

С помощью парамагнитных шариков выберите фрагменты в диапазоне от 250 до 500 пар оснований из библиотеки последовательностей ChIP, амплифицированной методом ПЦР. Используйте микрофлюидное устройство для капиллярного электрофореза ChIP для проверки качества выбранной библиотеки последовательностей ChIP.