Анизотропия флуоресценции для определения аффинности связывания фактора транскрипции и ДНК
JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 5:00 мин • July 8th, 2025
Фактор транскрипции, TF, представляет собой белок, который связывается со специфическим участком ДНК гена и регулирует транскрипцию.
Чтобы измерить взаимодействия TF-ДНК с помощью флуоресцентной анизотропии, возьмите многолуночный планшет. Добавьте в лунку расплавленный гель, смешанный с буферным раствором, содержащим известные концентрации меченой флуорофором референсной ДНК, содержащей TF-связывающий сайт и более высокую концентрацию молекул TF, и инкубируйте.
По мере того, как меченая референсная ДНК распределяется в геле, более высокая концентрация молекулы TF гарантирует, что все молекулы ДНК связаны с TF. Добавьте буферизованный раствор, содержащий немеченую ДНК конкурента с одноточечной мутацией.
Проанализируйте гель пластины с помощью высокоэффективной флуоресцентной анизотропной микроскопии.
Поляризованный свет возбуждает референсный флуорофор, связанный с ДНК, который переориентируется из-за молекулярного кувыркания и излучает разнонаправленный деполяризованный свет — явление, называемое флуоресцентной анизотропией, FA.
При связывании с TF молекулярная масса референсного связанного с ДНК флуорофора увеличивается, и он падает медленнее, излучая больше поляризованного света, что увеличивает FA.
Немеченая ДНК конкурента диффундирует по гелевой матрице с течением времени, образуя градиент от высокой к низкой концентрации. Более высокая концентрация ДНК немеченого конкурента вытесняет меченую референсную ДНК, связываясь с ТФ. Высвобожденные меченые референсные олигомеры кувыркаются быстрее, уменьшая FA.
Построите график FA флуорофора и градиента концентрации ДНК конкурента с течением времени, который уменьшается по мере того, как большее количество молекул конкурирующей ДНК вытесняет референсную ДНК.
Чтобы подготовить титровательные и калибровочные лунки 96-луночного планшета, перенесите два аликвота гелевого запаса в шейкер инкубатора с температурой 75 градусов Цельсия.
Для каждой лунки для титрования добавьте 1,4 наномоля эталонной ДНК, белок фактора транскрипции в конечной концентрации от 20 до 60 наномолей, 0,2 миллимоляра DTT и связывающий буфер до 240 микролитров расплавленного геля.
Тщательно перемешайте, переворачивая и встряхивая трубку. Затем медленно пипетируйте 200 микролитров ДНК-содержащего геля в специальные титруемые лунки 96-луночного планшета. Для каждой калибровочной лунки добавьте 5 наномолей красителя нильского синего в 240 микролитров расплавленного геля. Избегая образования пузырьков воздуха, медленно пипетируйте 200 микролитров раствора геля, содержащего краситель, в пять-шесть лунок 96-луночного планшета.
Поместите гель на идеально горизонтальную поверхность и выдерживайте 10 минут при комнатной температуре, а еще 10 минут при 4 градусах Цельсия. Используйте многолуночный планшетный ридер для проверки однородности уровней высоты геля в разных лунках пластины.
Чтобы получить раствор ДНК конкурента, сначала соедините меченую референсную ДНК, белок и трехкратный концентрированный связывающий буфер. Затем смешайте 20 микролитров раствора с 40 микролитрами каждого из отожженных растворов ДНК конкурентов.
Для каждой калибровочной лунки смешайте соответствующие количества одного из отожженных растворов ДНК конкурентов и трехкратного концентрированного связывающего буфера, содержащего 15-миллимолярный раствор красителя нильского синего. Наконец, добавьте 50 микролитров смешанных растворов конкурентов поверх гелей как можно быстрее.
Чтобы начать получение изображения, поместите 96-луночный планшет на предметный столик микроскопа. Затем возьмите временные ряды изображений лунок с z-стеком до полного отвязывания белка от референсной ДНК.
Провести анализ титрования в соответствии с рукописью. Затем используйте программное обеспечение HiP-FA для создания кривых титрования для отдельных последовательностей конкурентов. Затем нажмите кнопку «Экспорт», чтобы получить константу диссоциации и концентрацию активного белка в каждой лунке для титрования.
Обзор
В данной статье описан метод измерения взаимодействий между транскрипционными факторами (ТФ) и ДНК с помощью флуоресцентной анизотропии. Протокол включает подготовку многолуночной планшеты с гелем, содержащим меченную флуорофором ДНК и ТФ, с последующим анализом с использованием микроскопии высокоэффективной флуоресцентной анизотропии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Молекулярная биология
- Флуоресцентная микроскопия
Теоретические основы
- Транскрипционные факторы — это белки, которые регулируют экспрессию генов, связываясь со специфическими участками ДНК.
- Флуоресцентная анизотропия — это метод, используемый для изучения молекулярных взаимодействий.
- Понимание взаимодействий TF-ДНК имеет решающее значение для понимания механизмов регуляции генов.
- Данный метод позволяет осуществлять мониторинг этих взаимодействий в режиме реального времени.
Цель исследования
- Разработать надежный метод количественной оценки взаимодействий TF-ДНК.
- Использовать флуоресцентную анизотропию для измерения изменений молекулярной динамики при связывании.
- Предоставить детальный протокол для исследователей в данной области.
Используемые методы
- Подготовка многолуночного планшета с гелем, содержащим референтную ДНК и ТФ.
- Введение конкурирующей ДНК для оценки динамики связывания.
- Использование высокоэффективной микроскопии флуоресцентной анизотропии для анализа.
- Анализ данных с помощью программного обеспечения HiP-FA для построения кривых титрования.
Основные результаты
- Успешное измерение взаимодействий TF-ДНК с помощью флуоресцентной анизотропии.
- Демонстрация влияния конкурирующей ДНК на динамику связывания.
- Построение кривых титрования для определения констант диссоциации.
- Подтверждение эффективности метода для мониторинга в режиме реального времени.
Выводы
- Разработанный метод представляет собой надежный подход к изучению взаимодействий TF-ДНК.
- Флуоресцентная анизотропия эффективна для анализа молекулярного связывания в режиме реального времени.
- Данный протокол может быть адаптирован для различных транскрипционных факторов и последовательностей ДНК.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественная оценка аффинности связывания транскрипционных факторов с ДНК имеет решающее значение для валидации мишеней на ранних этапах разработки лекарственных препаратов, позволяя снизить механистические риски гипотез о регуляции генов. Флуоресцентная анизотропия обеспечивает считывание сигнала в жидкой фазе с использованием меток, что способствует разработке анализов для скрининговых кампаний, направленных на интерфейсы белок-ДНК. Данный метод позволяет получить количественные константы диссоциации, которые необходимы для идентификации ведущих соединений и повышения прогностической уверенности в отношении модуляторов транскрипции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Измерение аффинности связывания между транскрипционными факторами и специфическими последовательностями ДНК для подтверждения терапевтических гипотез.
- Практическая ценность: Использование конкурентного титрования для оценки специфичности и способности кандидатных молекул вытеснять лиганд.
- Прогностическая ценность: Построение кривых титрования и определение констант диссоциации для подтверждения надежности мишени и определения приоритетности ее изучения.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает мониторинг взаимодействий транскрипционных факторов с ДНК в режиме реального времени в гомогенном растворе.
- Практическая ценность: Совместим с многолуночными планшетами, что позволяет проводить среднепроизводительный скрининг библиотек соединений.
- Готовность анализа: Обеспечивает получение сигналов флуоресцентной анизотропии, которые напрямую коррелируют с соотношением связанных и свободных фракций ДНК.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: позволяет проводить механистические исследования путей регуляции генов, имеющих значение для моделей заболеваний.
- Соответствие биомаркерам: может быть адаптировано для оценки активности транскрипционных факторов в клеточных контекстах, релевантных конкретным заболеваниям.
- Преклиническое снижение рисков: предоставляет количественные данные о связывании для проведения исследований взаимодействия с мишенью in vivo.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум процесса поиска новых лекарственных средств — от валидации гипотезы о мишени через разработку анализа до оптимизации соединений-лидеров, особенно для мишеней, связанных с транскрипционной регуляцией.
- Биология открытий: Подтверждает, что связывание транскрипционного фактора с ДНК является доступным для воздействия лекарственных средств механизмом, и проясняет специфичность сайта связывания.
- Скрининг: Позволяет разрабатывать анализы на основе флуоресцентной анизотропии для скрининга малых молекул или пептидов, нарушающих взаимодействия белков с ДНК.
- Аналитика: Позволяет рассчитывать константы диссоциации и концентрации активного белка на основе кривых титрования, что обеспечивает количественное сравнение условий связывания.
- Трансляционные исследования: В сочетании с функциональными показателями связывает данные о связывании in vitro с клеточной транскрипционной активностью.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую биофизическую платформу для характеристики различных транскрипционных факторов и последовательностей ДНК в рамках разных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в функционировании транскрипционных факторов посредством прямого количественного измерения связывания.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимые данные в жидкой фазе с минимальным расходом образца и отсутствием артефактов иммобилизации.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), предоставляя ранние данные об аффинности и специфичности в отношении транскрипционных мишеней.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить риск-ориентированное продвижение соединений на основе подтвержденного взаимодействия с мишенью на уровне связывания с ДНК.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с флуоресцентной микроскопией и методами анализа взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами.
- Зависит от наличия высокопроизводительного оборудования для измерения флуоресцентной анизотропии и возможности подготовки образцов с использованием гелей.
- Необходимо тщательно разработать структуру меченных и конкурирующих олигонуклеотидов ДНК для обеспечения специфичности.
- Требуется оптимизация концентрации транскрипционного фактора и условий инкубации для достижения равновесного связывания.
- Метод ограничен растворимыми транскрипционными факторами и доступными мишенями ДНК; результаты могут не отражать состояние хроматина in vivo.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Расширение дрожжи один гибрид экраны для определения фактора транскрипции, привязка к последовательности ДНК человека
Похожие видео
0 Просмотры
Использование микромасштабного термофореза для измерения белково-липидных взаимодействий
Похожие видео
0 Просмотры
Определение термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина с использованием изотермической титрационной калориметрии
Похожие видео
0 Просмотры
Обнаружение белок-белковых взаимодействий на основе флуоресцентной анизотропии
Похожие видео
0 Просмотры
Электрофоретический анализ сдвига подвижности для обнаружения комплексов транскрипционный фактор-ДНК
Похожие видео
0 Просмотры
Количественный Анализ по изучению белок: ДНК взаимодействий, Discover транскрипционных регуляторов экспрессии генов, и идентифицировать новые противоопухолевых средств
Похожие видео
0 Просмотры
Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий
Похожие видео
0 Просмотры
При содействии формальдегида изоляции нормативных элементов для измерения доступности хроматина в клетках млекопитающих
Похожие видео
0 Просмотры
Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования
Похожие видео
0 Просмотры
Определение трехстороннего взаимодействия между двумя мономерами транскрипционного фактора MADS-бокса и белка датчика кальция методом анализа BiFC-FRET-FLIM
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026