Анизотропия флуоресценции для определения аффинности связывания фактора транскрипции и ДНК

Фактор транскрипции, TF, представляет собой белок, который связывается со специфическим участком ДНК гена и регулирует транскрипцию.

Чтобы измерить взаимодействия TF-ДНК с помощью флуоресцентной анизотропии, возьмите многолуночный планшет. Добавьте в лунку расплавленный гель, смешанный с буферным раствором, содержащим известные концентрации меченой флуорофором референсной ДНК, содержащей TF-связывающий сайт и более высокую концентрацию молекул TF, и инкубируйте.

По мере того, как меченая референсная ДНК распределяется в геле, более высокая концентрация молекулы TF гарантирует, что все молекулы ДНК связаны с TF. Добавьте буферизованный раствор, содержащий немеченую ДНК конкурента с одноточечной мутацией.

Проанализируйте гель пластины с помощью высокоэффективной флуоресцентной анизотропной микроскопии.

Поляризованный свет возбуждает референсный флуорофор, связанный с ДНК, который переориентируется из-за молекулярного кувыркания и излучает разнонаправленный деполяризованный свет — явление, называемое флуоресцентной анизотропией, FA.

При связывании с TF молекулярная масса референсного связанного с ДНК флуорофора увеличивается, и он падает медленнее, излучая больше поляризованного света, что увеличивает FA.

Немеченая ДНК конкурента диффундирует по гелевой матрице с течением времени, образуя градиент от высокой к низкой концентрации. Более высокая концентрация ДНК немеченого конкурента вытесняет меченую референсную ДНК, связываясь с ТФ. Высвобожденные меченые референсные олигомеры кувыркаются быстрее, уменьшая FA.

Построите график FA флуорофора и градиента концентрации ДНК конкурента с течением времени, который уменьшается по мере того, как большее количество молекул конкурирующей ДНК вытесняет референсную ДНК.

Чтобы подготовить титровательные и калибровочные лунки 96-луночного планшета, перенесите два аликвота гелевого запаса в шейкер инкубатора с температурой 75 градусов Цельсия.

Для каждой лунки для титрования добавьте 1,4 наномоля эталонной ДНК, белок фактора транскрипции в конечной концентрации от 20 до 60 наномолей, 0,2 миллимоляра DTT и связывающий буфер до 240 микролитров расплавленного геля.

Тщательно перемешайте, переворачивая и встряхивая трубку. Затем медленно пипетируйте 200 микролитров ДНК-содержащего геля в специальные титруемые лунки 96-луночного планшета. Для каждой калибровочной лунки добавьте 5 наномолей красителя нильского синего в 240 микролитров расплавленного геля. Избегая образования пузырьков воздуха, медленно пипетируйте 200 микролитров раствора геля, содержащего краситель, в пять-шесть лунок 96-луночного планшета.

Поместите гель на идеально горизонтальную поверхность и выдерживайте 10 минут при комнатной температуре, а еще 10 минут при 4 градусах Цельсия. Используйте многолуночный планшетный ридер для проверки однородности уровней высоты геля в разных лунках пластины.

Чтобы получить раствор ДНК конкурента, сначала соедините меченую референсную ДНК, белок и трехкратный концентрированный связывающий буфер. Затем смешайте 20 микролитров раствора с 40 микролитрами каждого из отожженных растворов ДНК конкурентов.

Для каждой калибровочной лунки смешайте соответствующие количества одного из отожженных растворов ДНК конкурентов и трехкратного концентрированного связывающего буфера, содержащего 15-миллимолярный раствор красителя нильского синего. Наконец, добавьте 50 микролитров смешанных растворов конкурентов поверх гелей как можно быстрее.

Чтобы начать получение изображения, поместите 96-луночный планшет на предметный столик микроскопа. Затем возьмите временные ряды изображений лунок с z-стеком до полного отвязывания белка от референсной ДНК.

Провести анализ титрования в соответствии с рукописью. Затем используйте программное обеспечение HiP-FA для создания кривых титрования для отдельных последовательностей конкурентов. Затем нажмите кнопку «Экспорт», чтобы получить константу диссоциации и концентрацию активного белка в каждой лунке для титрования.