Репортерный анализ репрессии генов для изучения трансляционной регуляции гена-мишени

РНК-связывающие белки, RBP, функционируют как посттранскрипционные регуляторы, связываясь с областью инициации трансляции, TIR, мРНК и подавляя трансляцию.

Для изучения взаимодействия РНК-RBP посредством трансляционной репрессии репортерного гена берут культуру бактериальных клеток, содержащую две плазмиды — сайт связывания и RBP-плазмиды.

Плазмида сайта связывания кодирует флуоресцентный репортерный ген. После транскрипции полученная мРНК TIR содержит сайт связывания рибосом и структуру шпильки с последовательностью, распознаваемой RBP.

Рибосомы связываются с сайтом связывания на мРНК и дестабилизируют структуру шпильки, что приводит к трансляции мРНК и образованию флуоресцентного репортерного белка. RBP-плазмида экспрессирует химерный RBP, слитый с другим флуоресцентным белком. Индуцируемый промотор контролирует экспрессию химерного белка.

Добавьте индуктор, который активирует транскрипционный фактор, который связывается с промотором, индуцируя экспрессию химерного белка. RBP химерного белка связывается со структурой шпильки. Это блокирует связывание рибосомы с мРНК, препятствуя трансляции репортерного белка.

С увеличением концентрации индуктора продукция RBP увеличивается, что приводит к более сильному конкурентному ингибированию рибосомального связывания с мРНК.

Измерьте различные сигналы флуоресценции от химерных и репортерных белков. Построение графиков сигналов, получение кривой "доза-реакция".

При индуктор-опосредованном увеличении продукции RBP трансляционная репрессия снижает концентрацию репортерного белка, подтверждая взаимодействие РНК-RBP.

Трансформируйте подготовленные плазмиды в химически компетентные бактериальные клетки, уже содержащие RBP-mCerulean плазмиду. Чтобы сэкономить время, пластинируйте клетки с помощью 8-канальной пипетки на 8-полосных планшетах, содержащих агар Лурия-Бертани, соответствующими антибиотиками. Колонии должны появиться через 16 часов при 37 градусах Цельсия.

Выберите одну колонию для каждого двойного трансформанта и переведите на 48-луночные планшеты, содержащие 1,5 миллилитров LB с соответствующими антибиотиками. Выращивайте клетки в течение 18 часов при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 250 об/мин. Храните запасы глицерина на ночь при температуре -80 градусов Цельсия в 96-луночных планшетах.

Утром запрограммируйте робота на нагрев 180 микролитров полубедной среды, или СЗМ, в 96-луночных планшетах. Запрограммируйте робота на подготовку индукторной пластины.

В чистом 96-луночном планшете подготовьте лунки с СЗМ, состоящими из 95% BA и 5% LB. Количество лунок соответствует желаемому количеству концентраций индукторов. Добавьте C4-HSL в лунки в индукторе, которые будут содержать самую высокую концентрацию индуктора.

Затем запрограммируйте робота на последовательное разбавление среды из каждой лунки с самой высокой концентрацией до 23 более низких концентраций в диапазоне от 0 до 218 наномоляров. Объем каждого разведения индуктора должен быть достаточным для всех штаммов.

Чтобы разбавить ночные штаммы, запрограммируйте робота на разбавление в 10 раз, смешав 20 микролитров бактерий со 180 микролитрами SPM в 48-луночных планшетах. Затем снова разбавьте в 10 раз, взяв 20 микролитров из разведенного раствора в заранее подготовленную деформационную пластину, пригодную для флуоресцентных измерений.

Теперь запрограммируйте робота на добавление разбавленного индуктора из индукторной пластины в 96-луночные планшеты с разбавленными деформациями в соответствии с конечными концентрациями. Встряхивайте 96-луночные планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 6 часов. В течение этого времени измеряйте оптическую плотность или OD на 595 нанометрах, а также флуоресценцию mCherry и mCerulean с помощью считывателя пластин каждые 30 минут.