Модифицированный гибридный анализ дрожжей-1 для выявления взаимодействий гетеромерного белкового комплекса и ДНК

Для выявления взаимодействий между гетеромерными белковыми комплексами, включающими несколько белков с целевой ДНК, с помощью модифицированного одногибридного анализа дрожжей берут многолуночный планшет, содержащий желаемую концентрацию активно растущей трансформированной культуры дрожжевых клеток.

Эти клетки содержат специфическую последовательность ДНК перед репортерным геном, кодирующим β-галактозидазу, управляемую промотором GAL-4, в то время как в них отсутствует эндогенный белок транскрипционного фактора GAL-4. Клетки экспрессируют белок-мишень, слитый с активационным доменом GAL-4, и другой белок, лишенный ДНК-связывающего домена GAL-4.

Если эти белки взаимодействуют, они могут образовывать комплекс, позволяющий белку-мишени связываться с восходящей последовательностью ДНК в промоторной области репортерного гена. Домен активации GAL-4 активирует экспрессию репортерного фермента β-галактозидазы.

центрифуга. Верните ячейки в подходящий буфер. Заморозьте-разморозьте клетки, чтобы лизовать их и высвободить β-галактозидазу. Добавьте бета-меркаптоэтанол и буфер, содержащий субстрат β-галактозидазы.

Бета-меркаптоэтанол стабилизирует фермент β-галактозидазу. β-галактозидаза гидролиз