Модифицированный гибридный анализ дрожжей-1 для выявления взаимодействий гетеромерного белкового комплекса и ДНК

Для выявления взаимодействий между гетеромерными белковыми комплексами, включающими несколько белков с целевой ДНК, с помощью модифицированного одногибридного анализа дрожжей берут многолуночный планшет, содержащий желаемую концентрацию активно растущей трансформированной культуры дрожжевых клеток.

Эти клетки содержат специфическую последовательность ДНК перед репортерным геном, кодирующим β-галактозидазу, управляемую промотором GAL-4, в то время как в них отсутствует эндогенный белок транскрипционного фактора GAL-4. Клетки экспрессируют белок-мишень, слитый с активационным доменом GAL-4, и другой белок, лишенный ДНК-связывающего домена GAL-4.

Если эти белки взаимодействуют, они могут образовывать комплекс, позволяющий белку-мишени связываться с восходящей последовательностью ДНК в промоторной области репортерного гена. Домен активации GAL-4 активирует экспрессию репортерного фермента β-галактозидазы.

центрифуга. Верните ячейки в подходящий буфер. Заморозьте-разморозьте клетки, чтобы лизовать их и высвободить β-галактозидазу. Добавьте бета-меркаптоэтанол и буфер, содержащий субстрат β-галактозидазы.

Бета-меркаптоэтанол стабилизирует фермент β-галактозидазу. β-галактозидаза гидролизует субстрат β-галактозидазы, образуя желтый хромоген.

Добавьте раствор карбоната натрия для денатурации β-галактозидазы и остановите реакцию. Центрифуга. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую желтый хромоген, на многолуночный планшет. С помощью считывателя пластин измерьте оптическую плотность раствора на подходящей длине волны, чтобы рассчитать активность β-галактозидазы.

Более высокая активность β-галактозидазы указывает на положительное взаимодействие между белками и последовательностью ДНК-мишени, что приводит к экспрессии β-галактозидазы.

Повторно суспендируйте культуру, и переложите по 125 микролитров из каждой лунки на пластину спектрофотометра. Измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах, чтобы убедиться, что она находится в диапазоне от 0,3 до 0,6. Центрифугируйте оставшиеся ячейки в блоке глубокого колодца при температуре 3000 g и 21 градусе Цельсия в течение 10 минут. Удалите надосадочную жидкость, перевернув ее.

Добавьте по 200 микролитров Z-буфера в каждую лунку и вортекс. Центрифугируйте при 3000 умноженных на g и 21 градусе Цельсия в течение 5 минут. Удалите надосадочную жидкость, перевернув ее. Добавьте по 20 микролитров Z-буфера в каждую лунку и вортекс. Накройте пластину герметизирующей пленкой, устойчивой к циклам замерзания-оттаивания.

В вытяжном шкафу выполните четыре цикла замораживания-размораживания с использованием жидкого азота на водяной бане при температуре 42 градуса Цельсия. Добавьте 200 микролитров свежеприготовленного Z-буфера/бета-меркаптоэтанола/раствора ONPG в каждую лунку. Инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение 17–24 часов или до тех пор, пока не разовьется цвет. Проверьте, что цвет развился.

Добавьте в каждую лунку по 110 микролитров 1 моляра карбоната натрия, чтобы остановить реакцию. Запишите время и закрутите пластину. Центрифугируйте при 3 000 умноженных на g и 21 градусе Цельсия в течение 10 минут. С помощью многоканальной пипетки передайте 125 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки на пластину спектрофотометра. Измерьте оптическую плотность на 420 нанометрах.