Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 4:10 мин. • July 8th, 2025
Белки с геликазной РНК могут помочь раскрутить и отделить отдельные молекулы РНК в дуплексе РНК.
Чтобы определить геликазную активность белка, берут пробирки, содержащие смесь меченных биотином РНК-дуплексов с 5'-выступом, АТФ и РНК-ловушек — немеченых цепей, комплементарных биотинилированным цепям дуплексов.
Добавьте белок с геликазной активности в каждую пробирку и инкубируйте в течение разной продолжительности. Белок связывается с 5'-выступом дуплексов.
Используя молекулы АТФ, он разрывает водородные связи между двумя дуплексными цепями, что приводит к их раскручиванию и высвобождению биотинилированной одноцепочечной РНК. РНК-ловушки взаимодействуют с меченными биотином цепями, предотвращая повторный отжиг с разделенными цепями.
Завершите реакцию с помощью буфера завершения.
Загрузите образцы в разные лунки с нативным полиакриламидным гелем. Провести электрофорез. Низкомолекулярная одноцепочечная РНК движется быстрее, чем высокомолекулярные дуплексы. Этот сдвиг мобильности порождает две отдельные полосы.
Промокните гель на нейлоновой мембране, перенося РНК на мембрану. После блоттинга подвергните мембрану воздействию ультрафиолетового света, сшивая РНК с мембраной.
Добавьте хеми
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео