Измерение активности геликазы белка-мишени с помощью меченых биотином дуплексов РНК

Белки с геликазной РНК могут помочь раскрутить и отделить отдельные молекулы РНК в дуплексе РНК.

Чтобы определить геликазную активность белка, берут пробирки, содержащие смесь меченных биотином РНК-дуплексов с 5'-выступом, АТФ и РНК-ловушек — немеченых цепей, комплементарных биотинилированным цепям дуплексов.

Добавьте белок с геликазной активности в каждую пробирку и инкубируйте в течение разной продолжительности. Белок связывается с 5'-выступом дуплексов.

Используя молекулы АТФ, он разрывает водородные связи между двумя дуплексными цепями, что приводит к их раскручиванию и высвобождению биотинилированной одноцепочечной РНК. РНК-ловушки взаимодействуют с меченными биотином цепями, предотвращая повторный отжиг с разделенными цепями.

Завершите реакцию с помощью буфера завершения.

Загрузите образцы в разные лунки с нативным полиакриламидным гелем. Провести электрофорез. Низкомолекулярная одноцепочечная РНК движется быстрее, чем высокомолекулярные дуплексы. Этот сдвиг мобильности порождает две отдельные полосы.

Промокните гель на нейлоновой мембране, перенося РНК на мембрану. После блоттинга подвергните мембрану воздействию ультрафиолетового света, сшивая РНК с мембраной.

Добавьте хемилюминесцентный фермент-конъюгированный стрептавидин, который взаимодействует с биотином на дуплексах и одноцепочечных цепях. Используйте хемилюминесцентные подложки для производства хемилюминесцентных продуктов.

При визуализации интенсивность низкомолекулярной полосы со временем увеличивается, коррелируя с геликазной белка-мишени.

Для анализа активности геликазы MOV10 смешайте реагенты в соответствии с инструкциями в рукописи и добавьте воду для получения конечного объема реакции 20 микролитров. Инкубируйте реакцию при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, 30 минут и 60 минут, а затем добавьте 5X Stop Buffer, чтобы остановить реакцию. Затем приготовьте 20% нативный полиакриламидный гель и загрузите от 20 до 25 микролитров каждого образца в каждую лунку. Запустите гель при напряжении 100 вольт на ледяной бане, пока бромофенольный синий маркер не мигрирует в нижнюю четверть геля.

Акриламид вреден и токсичен. Важно обращаться с ним с помощью соответствующих средств индивидуальной защиты.

Разберите гелевые пластины и обрежьте гель, удалив загрузочные колодцы и неиспользуемые полосы. Поместите гель в буфер 0,5X TBE. Отрежьте фильтровальную бумагу и капроновую мембрану по размеру геля, предварительно намочите бумагу и мембрану и соберите стопку для переноса.

Перенесите образцы из геля на мембрану в полусухом электрофоретическом аппарате при давлении 90 миллиампер в течение 20 минут. Затем сшите образцы путем облучения мембраны с частотой 120 миллиджоулей на квадратный сантиметр в течение 45-60 секунд.

Для обнаружения хемилюминесценции начните с добавления 20 миллилитров блокирующего буфера в мембрану и инкубируйте ее в течение 15-30 минут, осторожно встряхивая. Осторожно извлеките блокирующий буфер и замените его сопряженным блокирующим буфером. Снова инкубируйте мембрану в течение 15 минут.

Промойте мембрану четыре раза, встряхивая в течение 5 минут за одну стирку. Затем добавьте 30 миллилитров буфера для уравновешивания субстрата в мембрану и инкубируйте его в течение 5 минут, встряхивая со скоростью от 20 до 25 оборотов в минуту.

Покройте всю поверхность мембраны рабочим раствором субстрата и выдержите 5 минут. После инкубации отсканируйте мембрану в хемилюминесцентной системе визуализации в течение 1–3 секунд.