Иммунофлуоресцентная визуализация белковых взаимодействий репарации ДНК

Радиационно-индуцированные двухцепочечные разрывы ДНК, или DSB, инициируют рекрутирование белка репарации ДНК в поврежденном месте, активируя репарацию ДНК.

Для обнаружения белков репарации ДНК γH2AX и 53BP1 в сайтах DSB с помощью непрямой иммунофлюоресценции берут покровные стекла, содержащие эпителиальные клетки. Облучите подмножество клеток. Инкубируйте, позволяя необлученным и облученным клеткам контрольной группы расти в течение определенного времени.

Обработайте буфером для извлечения ядра клеток. Фиксируйте ядра клеток, чтобы сохранить их морфологию. Проводите лечение с помощью блокирующего раствора, чтобы свести к минимуму связывание неспецифических первичных антител.

Добавьте первичные антитела, нацеленные на два белка репарации ДНК. Антитела связываются с соответствующими белками.

Инкубируйте с вторичными антителами, помеченными красными и зелеными флуорофорами соответственно. Вторичные антитела, специфичные для каждого первичного антитела, связываются со своими мишенями. Добавьте монтажный материал, содержащий DAPI, на предметное стекло. Закрепите на нем покровные стекла для визуализации.

DAPI — ДНК-связывающий краситель — связывается с богатыми АТ малыми бороздками двухцепочечной ДНК, уравновешивая ядра. Визуализируйте ядра клеток с помощью флуоресцентного микроскопа.

По сравнению с необлученными ядрами клеток, облученные ядра демонстрируют множественные очаги γH2AX, которые со временем уменьшаются, что указывает на прогрессирующую репарацию ДНК в клетках, выращиваемых в течение более длительных периодов времени.

Перекрывающиеся красный и зеленый флуоресцентные сигналы отображаются желтым, указывая на совместную локализацию γH2AX и 53BP1 в сайте DSB после облучения.

Начните с выращивания 40 000 клеток HeLa в каждой лунке 12-луночного планшета с 18-миллиметровым круглым стеклянным покровным стеклом до 80% конфлюенции. После воздействия на клетки гамма-излучения 4 Грея дважды промойте их 1 миллилитром PBS. Затем полностью удалите PBS и добавьте по 200 микролитров NEB в каждую лунку. Инкубируйте клетки в течение 2 минут при комнатной температуре, затем удалите NEB.

Имейте в виду, что время инкубации может варьироваться в зависимости от клеточной линии, но в целом не должно превышать двух минут. Промойте клетки 1 миллилитром PBS. Затем полностью удалите PBS и добавьте 200 микролитров 4% PFA в каждую лунку для фиксации клеток.

Инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия, затем удалите PFA и добавьте по 1 миллилитру PBS в каждую лунку. Полностью удалите PBS, а затем добавьте 200 микролитров блокирующего раствора в каждую лунку и инкубируйте клетки в течение 2 часов при комнатной температуре или от 16 до 18 часов при 4 градусах Цельсия.

Разведите первичное антитело в буфере для разведения и перемешайте его до тех пор, пока оно не станет хорошо перемешанным. В коробку с влажностью приклейте кусок парапленки и добавьте 10 микролитров первичного антитела в одной капле. Совместите один край покровного стекла от лунки с каплей, и медленно опустите его на парапленку, размазывая жидкость. Выдержать покровный лист в течение 2 часов при комнатной температуре.

После инкубации промойте покровные стекла три раза в PBS по 1 минуте за одну стирку. Разведите вторичное антитело в буфере для разведения и вихре до однородности. Нанесите 10 микролитров вторичного антитела на каждый покровный лист, как описано ранее, и инкубируйте в течение 2 часов при комнатной температуре, в защищенном от света месте.

Промойте покровные стекла три раза PBS и один раз водой в течение 1 минуты за одну стирку. Затем закрепите их на стеклянных предметных стеклах с помощью монтажной среды на основе глицерина, содержащей DAPI. Заклейте покровные листы прозрачным лаком для ногтей и дайте им высохнуть в течение 20 минут. Нанесите каплю иммерсионного масла на объектив с 60-кратным увеличением и с помощью DAPI найдите ядра через окуляр.

Для получения изображений XYZ откройте программное обеспечение для сбора данных и установите для параметра "Тип сканера" значение "Galvano", для параметра "Режим сканера" значение "Round Trip" и размер изображения "512 на 512". На панели PMT установите режим VBM, среднее значение — Кадр, а последовательное сканирование — Линия. Далее устанавливаем датчики красителя и тепла. Установите канал 1 на DAPI и SD1, второй канал на Alexa Fluor 488 и HSD3, а канал 3 на Alexa Fluor 647 и HSD4. Выберите «ВКЛ» в поле «Z».

Чтобы настроить изображение в режиме реального времени, нажмите кнопку «Трансляция» в окне «Трансляция» и отрегулируйте фокус. Затем в окне «Инструмент ФЭУ» установите интенсивность, чувствительность, усиление и смещение лазера. Для стеков Z выберите «От начала до конца» и «15 срезов». Выберите папку для сохранения изображений и нажмите кнопку LSM Start, чтобы начать эквайринг. По завершении нажмите кнопку «Серия готово», чтобы завершить получение изображения.