Анализ вытягивания РНК-белка для выделения РНК-связывающих белков с помощью аффинной экстракции

Для выделения РНК-связывающих белков, или RBP — посттранскрипционных регуляторов — берут суспензию малых РНК-зондов, содержащих элемент, богатый аденилат-уридилатами, или ARE — последовательность, распознаваемую мишенью RBP. РНК-зонды помечены дестиобиотином — производным биотина.

Добавьте магнитные шарики, покрытые стрептавидином — белком, обладающим сродством к биотину. Инкубируйте под перемешиванием, чтобы предотвратить оседание бусин. РНК, меченная дестиобиотином, связывается со стрептавидином, тем самым иммобилизуя РНК на шариках.

Под действием магнитного поля шарики собираются на боковой стороне трубки. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте шарики в буфере, обеспечивая оптимальный pH для связывания RBP-RNA.

При воздействии на магнит бусины собираются на боковой стороне трубки. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте шарики в растворе, содержащем целевые RBP, и инкубируйте при перемешивании.

Целевые RBP обладают мотивами узнавания РНК, которые распознают последовательность ARE и связываются с РНК, образуя таким образом РНК-белковый комплекс, иммобилизованный на бусинах.

Под действием магнитного поля шарики движутся к магниту, не нарушая взаимодействия белка и РНК. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте шарики в элюирующем буфере, содержащем биотин.

Биотин вытесняет дестиобиотин из гранул, конкурентно связываясь со стрептавидином, тем самым элюируя комплекс белок-РНК.

Оцените наличие целевых RBP в элюате для подтверждения белок-РНК-взаимодействий.

Предварительно промойте 50 микролитров стрептавидин-магнитных шариков на 50 пикомоль РНК. Закрутите трубку стрептавидин-магнитными шариками в течение 15 секунд. После быстрого вортекса удалите 200 микролитров в чистую безопасную пробирку объемом 1,5 миллилитра с помощью отрезанных наконечников для пипетки. Далее поместите трубку на магнитную подставку так, чтобы бусины собрались сбоку от трубки, и подождите одну минуту. Удалите жидкость для повторного суспензирования.

Чтобы промыть бусины, снимите трубку с магнитной подставки на 400 микролитров 0,1 моляра гидроксида натрия, 0,05 моляра раствора натрия хлорида и аккуратно пипеткой вверх и вниз несколько раз. Поместите трубку обратно на магнитную подставку и подождите одну минуту, затем соберите надосадочную жидкость.

Промойте шарики 200 микролитрами 100-миллимолярного хлорида натрия и удалите надосадочную жидкость. Добавьте 200 микролитров 20 миллимоляров Триса. Подвешиваем бусины с помощью пипетирования и помещаем трубку на магнитную подставку. Через одну минуту удалите надосадочную жидкость. Затем извлеките пробирку из магнитной стойки на 200 микролитров 1x буфера захвата РНК и ресуспендируйте стрептавидин-магнитные шарики путем кратковременного вортексирования.

Удалите 50 микролитров стрептавидиновых магнитных шариков и добавьте их в каждую пробирку с меченой РНК с помощью отрезанного наконечника для пипетки. Инкубируйте трубки в течение 30 минут при комнатной температуре на ролике. После того как трубка простоит на магнитной подставке одну минуту, извлеките надосадочную жидкость. Добавьте 50 микролитров 20 миллимолярного триса в бусины и снова суспендируйте их. Затем поместите трубки в магнитную подставку. Через одну минуту удалите надосадочную жидкость.

Добавьте 100 микролитров 1x белок-РНК-связывающего буфера в гранулы и повторно суспендируйте их. Затем поместите трубки обратно в магнитную подставку. Как только трубки простоят в подставке 1 минуту, соберите надосадочную жидкость. Добавьте 100 микролитров мастер-смеси B. Восстановите суспендию, аккуратно пипетируя вверх и вниз, чтобы избежать образования пузырьков. Инкубируйте реакционные пробирки в течение 60 минут при температуре 4 градуса Цельсия на ролике.

Переходите к этапам стирки и элюирования. Поместите трубки на магнитную подставку. Соберите проточный поток и переложите его в новую трубу. Пипетка 100 микролитров 1X смываем буфер на шарики. Осторожно приостановите. Положите их обратно на подставку. Подождите одну минуту и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг два раза.

Добавьте в магнитные шарики 40 микролитров элюирующего буфера. Перемешивайте с помощью пипетирования вверх и вниз и инкубируйте в трубочном шейкере. Поместите трубки в магнитную стойку, подождите одну минуту и соберите образец элюирования. Поместите на лед и используйте для последующего анализа.