Анализ вытягивания РНК-белка для выделения РНК-связывающих белков с помощью аффинной экстракции

Для выделения РНК-связывающих белков, или RBP — посттранскрипционных регуляторов — берут суспензию малых РНК-зондов, содержащих элемент, богатый аденилат-уридилатами, или ARE — последовательность, распознаваемую мишенью RBP. РНК-зонды помечены дестиобиотином — производным биотина.

Добавьте магнитные шарики, покрытые стрептавидином — белком, обладающим сродством к биотину. Инкубируйте под перемешиванием, чтобы предотвратить оседание бусин. РНК, меченная дестиобиотином, связывается со стрептавидином, тем самым иммобилизуя РНК на шариках.

Под действием магнитного поля шарики собираются на боковой стороне трубки. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте шарики в буфере, обеспечивая оптимальный pH для связывания RBP-RNA.

При воздействии на магнит бусины собираются на боковой стороне трубки. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте шарики в растворе, содержащем целевые RBP, и инкубируйте при перемешивании.

Целевые RBP обладают мотивами узнавания РНК, которые распознают последовательность ARE и связываются с РНК, образуя таким образом РНК-белковый комплекс, иммобилизованный на бусинах.

Под действием магнитного поля шарики движутся к магниту, не нарушая взаимодействия