Микромасштабный термофорез для изучения белок-липидных взаимодействий в растворе

Чтобы изучить взаимодействие белков с молекулами липидов, начните с двух капиллярных трубок. Добавьте флуоресцентные тест-белки, меченные красителем, в обе пробирки и немеченные молекулы липидов в одну из них. Поместите эти капилляры в массив и поместите их внутрь микромасштабного термофореза.

Облучайте содержащий белок капилляр сфокусированным инфракрасным светом, создавая повышение температуры в фокальном пятне, которое диффундирует через раствор, создавая температурный градиент в узкой области, содержащей флуоресцентно меченные белки.

Флуоресцентный детектор собирает флуоресцентный сигнал из того же места капилляра, где сфокусирован лазер. Процессор преобразует сигнал и генерирует график относительной флуоресценции в зависимости от времени.

При температурном градиенте меченые белки начинают мигрировать из более горячей области в более холодную, демонстрируя термофорез — явление температурно-зависимой миграции.

Из-за термофореза интенсивность флуоресценции постепенно уменьшается с течением времени и достигает устойчивого состояния, в котором меченые белки достигают равновесия.

Облучайте капилляры, содержащие белково-липидную смесь, создавая температурный градиент.

Во время термофореза мигрирующие меченые белки взаимодействуют с молекулами липидов, образуя липидно-белковые комплексы с более высокими молекулярными массами. Это приводит к задержке их движения.

Эта дифференциальная миграция вызывает сдвиг флуоресценции, подтверждая успешное белок-липидное взаимодействие.

Прежде чем начать анализ, включите выключатель питания на задней панели устройства MST и откройте управляющее программное обеспечение. Убедитесь, что компьютер подключен к устройству и находится в состоянии «Подключено», а для параметра MST «До» установите значение 3 секунды, значение MST — на 30 секунд, а для параметра «Восстановление флуоресценции» — значение «Через 1 секунду».

Для каждой капиллярной трубки введите название лиганда-мишени, название аналита лиганда, концентрацию мишени и максимальную концентрацию титрования, используя коэффициент титрования автозаполнения. Выберите диапазон мощностей MST и введите значения для каждой мощности, чтобы проверить наиболее надежное прилегание креплений.

Для приготовления меченых образцов MST разбавляют раствор Vam7-октагистидина до 200-наномолярной концентрации и краситель NTA-Atto 647 до 100-наномолярной концентрации, оба в PBS. Смешайте Vam7-октагистидин и краситель NTA-Atto 647 в соотношении 1 к 1 и оставьте смесь при комнатной температуре, защищенной от света, в течение 30 минут. В конце инкубации центрифугируйте смесь красителя и белка и храните раствор при температуре 4 градуса Цельсия до нескольких часов перед использованием. Затем подготовьте образец. Возьмите краситель в лиганд и обнажите аналит.

Для микромасштабного термофореза образца откройте устройство и выдвиньте капиллярный штатив наружу. Загрузите капилляры для образцов в штатив с наибольшей концентрацией в положении 1 и выберите красный канал в управляющем программном обеспечении. Затем загрузите стойку в прибор. Затем выберите диапазон мощности MST и запустите измерение Cap Scan + MST и оцените реакцию сдвига.