JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 2:43 мин • July 8th, 2025
Белок-фосфолипидные взаимодействия на клеточной мембране имеют решающее значение для регуляции нескольких клеточных процессов.
Чтобы обнаружить целевые белок-фосфолипидные взаимодействия in vitro с помощью количественной проточной цитометрии, возьмите пробирку, содержащую в буфере желаемую концентрацию имитации клеточной мембраны — микронных меченых липофильными красителями фосфолипидных везикул.
Добавьте в раствор соответствующую концентрацию различных флуоресцентно меченных целевых белков.
Введите суспензию в проточный цитометр. Установите параметры жидкостной системы на низкую скорость потока, чтобы обеспечить достаточное время для белок-фосфолипидных взаимодействий.
По мере того, как флуоресцентно меченые белки и фосфолипидные везикулы взаимодействуют в проточном канале, концентрация белков, связанных с везикулами, увеличивается.
Когда эти комплексы проходят через лазерные лучи от определенных флуоресцентных каналов, обеспечивающих соответствующие длины волн, они возбуждаются. Эти возбужденные белки и фосфолипидные везикулы в комплексе при релаксации до основного состояния излучают соответствующие флуоресцентные сигналы, которые улавливаются соответствующими детекторами.
Обнаружение высокой средней интенсивности флуоресценции белков свидетельствует о связывании белка с фосфолипидными везикулами.
Эксперименты по кинетическому связыванию начинают с разбавления фосфолипидных везикул в буфере Тайроде до концентрации 1 микромоль и общего объема 250 микролитров. Затем смешайте меченный флуоресцентными материалами фактор свертывания X или fX-fd в концентрации 500 наномоляров с фосфолипидными везикулами в соотношении 1:1, чтобы получить общий объем 500 микролитров.
Немедленно введите 500 микролитров смешанной суспензии в проточный цитометр со скоростью потока с длиной волны возбуждения 488 нм и эмиссионным фильтром 585 нм с шириной 42 мкм для канала FL2.
Затем измерьте среднюю флуоресценцию в канале FL4 с возбуждением на 633 нм и эмиссионном фильтре на 660 нм с шириной 20. Когда насыщение связывания достигнуто, быстро разбавьте образец в 20 раз буфером Тайроде и контролируйте диссоциацию до тех пор, пока не будет достигнута базовая флуоресценция или плато.