Метод диссипативной микрогравиметрии для изучения белок-липидного бислойного взаимодействия

Для изучения взаимодействия фосфолипидсвязывающего белка и липидного бислоя с помощью диссипативной микрогравиметрии берут микровесы с кварцевым сенсором. При подаче соответствующего напряжения кварцевый слой, зажатый между двумя металлическими электродами, колеблется с определенной частотой.

Добавьте на датчик суспензию небольших однослойных пузырьков, состоящих из одного липидного бислоя. Везикулы адсорбируются на гидрофильной поверхности, покрытой кремнеземом, увеличивая массу сенсора и пропорционально уменьшая частоту его колебаний.

Заполненные буфером везикулы действуют как вязкоупругий слой, что приводит к диссипации — гашению колебаний. Адсорбированные везикулы разрываются, высвобождая заключенный буфер. Результирующее уменьшение массы увеличивает частоту колебаний.

Разорванные пузырьки образуют непрерывный бислой, имитирующий биологическую мембрану. Жесткость бислоя уменьшает дипсипацию.

Добавьте буфер, содержащий ионы кальция, вместе с целевым белком. Ионы кальция связываются с белком и изменяют его конформацию, что позволяет связываться с молекулами липидов в бислое.

Связывание с белками увеличивает массу сенсора, что приводит к снижению частоты. Структурная целостность бислоя остается незатронутой, что приводит лишь к незначительному увеличению диссипации.

Добавьте хелатирующий агент для хелатирования ионов кальция, диссоциировав белки из бислоя.

Отсутствие связанных белков возвращает частоту и диссипацию колебаний к уровням, не связанным с белками, подтверждая, что связывание зависит исключительно от кальция и что бислой остается неповрежденным.

Осторожно пристыкуйте очищенные от плазмы датчики к четырем проточным камерам с помощью пинцета. Избегайте любого давления или скручивания камер и трубок, которые могут привести к утечке. Промыть систему цитратным буфером в режиме открытого потока в течение 10 минут.

Запустите программу. Начните записывать любые изменения частоты и рассеивания первого основного тона и обертонов с помощью программного обеспечения до тех пор, пока частота и базовая линия диссипации не станут стабильными.

Когда базовые показатели стабилизируются, примените суспензию SUV в буфере из цитратов. С помощью реакционного сосуда удалите 1,5 миллилитра мертвого объема. Затем закройте систему в режиме петли потока. Запишите сдвиг диссипации частот еще на 10 минут.

Когда SLB стабилизируется, уравновесьте систему с работающим буфером при требуемых концентрациях кальция в режиме открытого потока в течение 40 минут. Добавьте белок в беговой буфер, содержащий кальций. Выполняйте применение белка в режиме петлевого потока до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное устойчивое состояние.