Анализ модуляции pH на поддерживаемых липидных бислоях для обнаружения белок-фосфоинозитидных взаимодействий

Фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат, или PIP2, представляет собой микросвязанный мембранно связанный фосфорилированный фосфолипид. Фосфолипаза С, или ПЛК, со специфическими PIP2-связывающими доменами, связывается с PIP2, генерируя вторичные мессенджеры, необходимые для нескольких клеточных процессов.

Чтобы обнаружить взаимодействия PLC-PIP2 in vitro, начните с небольшой униламеллярной везикулы, SUV, кислотной суспензии, содержащей PIP2 и смесь фосфолипидов, один из которых конъюгирован с pH-чувствительным флуоресцентным красителем.

Нанесите раствор пипеткой во входное отверстие предварительно собранного изготовленного микрофлюидного устройства и подсоедините выходную трубку. Перенесите и закрепите прибор на предметном столике флуоресцентного микроскопа. Под действием силы тяжести внедорожники проходят через микроканал пола, выполненный из гидрофильного стекла покровного стекла.

Внедорожники адсорбируются на поверхности стекла, а pH раствора снижает электростатическое отталкивание между ними. Внедорожники взаимодействуют с поверхностью, деформируясь и сплавляясь, образуя большие везикулы.

После критического покрытия поверхности везикулы спонтанно разрываются, образуя поддерживаемый липидный бислой, SLB. Пропустите через канал буфер, удалив неадсорбированные пузырьки.

Используя подходящий флуоресцентный канал, визуализируйте микроканал для визуализации и измерения pH-чувствительной флуоресценции красителя — высокой флуоресценции при низком pH — в SLB.

Введите в микроканал рекомбинантный раствор ПЛК. Нейтральный pH раствора, расположенный ниже изоэлектрической точки ПЛК, делает ПЛК положительно заряженным.

Рекомбинантный ПЛК со своим PIP2-связывающим доменом связывается с PIP2, рекрутируя отрицательно заряженные гидроксид-ионы на поверхность бислоя. Это делает поверхность бислоя более базовой, изменяя состояние протонирования красителя и вызывая гашение флуоресценции, что указывает на взаимодействия PLC-PIP2.

Перенесите 100 микролитров фосфатидилинозитол-4 5-бисфосфата, содержащего мелкие униламеллярные везикулы, в микроцентрифужную пробирку объемом 0,65 миллилитров. Отрегулируйте pH раствора примерно до 3,2, добавив 6,4 микролитра 0,2 нормальной соляной кислоты.

Направьте пипеткой 10 микролитров отрегулированного по pH раствора малых униламеллярных везикул в каждый канал через входное отверстие и давите через пипетку до тех пор, пока раствор не достигнет выходного отверстия. Отсоедините наконечник от пипетки и оставьте его прикрепленным к устройству. Повторив этот шаг для каждого канала, выдержите устройство в течение 10 минут при комнатной температуре.

Введение везикул в микроканалы должно выполняться сразу после сборки устройства. Тем временем отрежьте комплекты входных и выходных трубок. С помощью пинцета подсоедините набор выходных трубок к прибору, а затем прикрепите прибор скотчем к предметному столику для микроскопа.

Погрузите один конец входной трубки в 25 миллилитров рабочего буфера, содержащегося в конической трубке, и обмотайте его лентой, чтобы убедиться, что трубка надежно закреплена. С помощью лабораторного домкрата поместите коническую трубку на возвышенность, чем устройство, чтобы раствор проталкивался через микроканалы под действием силы тяжести.

Для каждой входной трубки с помощью шприца наберите 1 миллилитр рабочего буфера со свободного конца трубки. Извлеките наконечник пипетки из впускного отверстия и вставьте свободный конец впускной трубки в устройство. Повторите этот процесс, чтобы подсоединить все части входной трубки к устройству. Протекающий проточный буфер через каналы помогает удалить избыток неразорвавшихся пузырьков и уравновесить бислой до экспериментальных условий.

Далее откройте программное обеспечение для управления микроскопом. На левой панели нажмите на вкладку «Микроскоп» и выберите объектив «10x». Нажмите «Live», а затем значки изображений «Alexa 568» на панели инструментов. С помощью ручек Тонкая и Грубая регулировка сосредоточьтесь на микроканалах. Просканируйте устройство, чтобы проверить качество SLB и каналов.

Затем нажмите на значок изображения «FL Shutter Closed» на панели инструментов. Перейдите на вкладку «Получение» и в разделе «Основные корректировки» выберите время воздействия. Установите время экспозиции на 200 миллисекунд. На левой панели нажмите на «Многомерное получение». В меню «Фильтры» выберите красный канал. Затем нажмите на меню «Таймлапс». Установите временной интервал 5 минут, продолжительность 30 минут и меню lapse.

Выберите инструмент "Круг" на вкладке "Измерить" и нарисуйте круг в любом канале. Щелкните правой кнопкой мыши, когда круг выделен, и выберите «Свойства». На вкладке "Профиль" отметьте "all T", чтобы увидеть интенсивность флуоресценции в зависимости от времени. Убедитесь, что эта кривая достигает плато, которое указывает на равновесие, прежде чем переходить к следующему шагу.

Опустите буферный раствор на такую же землю, как устройство для остановки потока. По одному отсоедините каждую выходную трубку и внесите по 200 микролитров каждого разбавления белка в выходной канал с помощью пипетки. Не давите. Позвольте гравитации сделать свою работу. Отсоедините наконечник от пипетки и оставьте его прикрепленным к микрофлюидному устройству. Повторите этот процесс для каждого канала, чтобы убедиться, что во время этого процесса в каналы не попадают пузырьки воздуха.

Затем опустите входную трубку на землю под микрофлюидным устройством, чтобы начать подачу белка по микроканалам. Прикрепите свободный конец трубки к контейнеру для отходов. Протекайте разведениями домена гомологии Плекстрина в течение 30 минут. На левой панели программного обеспечения на вкладке «Таймлапс» нажмите «Старт», чтобы снова начать съемку.