Дифференциальная сканирующая калориметрия для изучения взаимодействия аптамера ДНК с термолабильным лигандом

Дифференциальная сканирующая калориметрия помогает изучать взаимодействие биомолекулы и лиганда путем измерения тепла, необходимого для денатурации биомолекулы в отсутствие и в присутствии лиганда.

Для начала возьмем эталон, содержащий аптамеры свободной ДНК — структурированные одноцепочечные олигонуклеотиды — и образец, содержащий термолабильные лиганд-связанные аптамеры. Лиганды стабилизируют вторичную структуру аптамера.

Выполните прямое сканирование, нагревая растворы. При достижении температуры плавления свободные аптамеры денатурируют.

Стабилизированные лигандом аптамеры диссоциируют от лигандов и денатурируются при относительно более высокой температуре, вызывая повышение температуры плавления по сравнению со свободными аптамерами. При высоких температурах подмножество лигандов приобретает необратимую вторичную форму с низким сродством к связыванию.

Затем выполните обратное сканирование, охладив растворы, чтобы восстановить структуру аптамера. При более низкой температуре исходный и преобразованный лиганды в образце связываются с аптамерами.

Во время второго прямого сканирования аптамеры, связанные со слабым сродством к преобразованным лигандам, диссоциируют и денатурируются при более низкой температуре, чем исходные связанные с лигандом аптамеры, что приводит к снижению температуры плавления.

При последовательном сканировании лиганды продолжают превращаться во вторичную форму, что приводит к полному истощению исходной формы. Получите термограмму.

С каждым сканированием температура плавления связанного с лигандом аптамера смещается в сторону свободного аптамера, что указывает на слабое сродство к связыванию вторичной формы.

Дегазируйте растворы буфера, биомолекулы и лиганда в настольном дегазаторе перед загрузкой в дифференциальный сканирующий калориметр (ДСК). Открутите ручку давления от ДСК. Затем проложите силиконовую трубку от рабочего буфера, и присоедините ее к переднему фланцу опорного капилляра.

Создайте мост между эталонным и образцом капилляров, присоединив задний опорный фланец к переднему фланцу образца. Затем прикрепите кусок силиконовой трубки к заднему фланцу для образца, который идет к колбе для отходов с прикрепленной вакуумной линией. Включите вакуумную линию, чтобы промыть ДСК 200 миллилитрами рабочего буфера.

Начните с прикрепления примерно 3-5-сантиметровых секций силиконовых трубок к контрольным капиллярным фланцам. Далее вставьте наконечник для пипетки объемом 1 миллилитр в силиконовую трубку заднего фланца. Наберите пипеткой 0,8 миллилитра рабочего буфера и вставьте наконечник пипетки с буфером в силиконовую трубку переднего референца опорного фланца.

Осторожно нажмите на поршень пипетки, чтобы пропустить рабочий буфер через переднюю силиконовую трубку в контрольный капилляр и вверх в прикрепленный наконечник пипетки заднего фланца. Нажимайте на поршень пипетки до тех пор, пока уровень рабочего буфера не достигнет чуть выше передней силиконовой трубки. Затем отпустите поршень пипетки до тех пор, пока уровень рабочего буфера не достигнет чуть выше задней силиконовой трубки. Продолжайте пропускать рабочий буфер вперед и назад в опорном капилляре, чтобы продуть объем пузырьков.

Затем закройте задний наконечник пипетки указательным пальцем и осторожно потяните вверх задний и передний наконечники пипетки, чтобы снять их с контрольных фланцев с прикрепленной силиконовой трубкой. Загрузите в капилляр образца рабочий буфер, как и раньше.

Установите черный пластиковый колпачок на задний контрольный фланец и фланец образца, оставив передние фланцы открытыми. Прикрепите ручку давления к DSC, а затем откройте программное обеспечение DSC и нагнетайте давление в приборе, нажав красную стрелку «Вверх» в верхней части интерфейса, как только показания мощности стабилизируются. Мощность ЦИВ отображается в поле в правом верхнем углу интерфейса вместе с показаниями температуры и давления прибора.

Уравновесьте ДСК с рабочим буфером, выполнив прямое и обратное сканирование. На вкладке «Экспериментальный метод» в левой части экрана убедитесь, что выбрана опция «Сканирование» для запуска DSC в режиме сканирования температуры.

Во вкладке «Температурные параметры» на вкладке «Экспериментальный метод» нажмите кнопку обогрева. Введите 1 и 100 градусов Цельсия для нижней и верхней экспериментальных температур, 1 градус Цельсия в минуту для скорости сканирования и 60 секунд для периода равновесия. Нажмите кнопку «Добавить ряд» под полем ввода для периода уравновешивания . Введите 2 в поле «Шаги для добавления» во всплывающем окне и поставьте галочку в поле «Альтернативное отопление/охлаждение». Нажмите «ОК».

Добавленные сканы отображаются в нижней части интерфейса. Убедитесь, что параметры для каждого сканирования соответствуют желаемым. Начните эксперимент, нажав зеленую кнопку "Воспроизвести" в верхней части интерфейса. Перейдите в нужное окно и введите имя файла для сохранения эксперимента во всплывающем окне. Чтобы посмотреть ход выполнения эксперимента, нажмите на вкладку «Данные» справа от вкладки «Метод эксперимента».

Проведите контрольные эксперименты для базового вычитания данных образца путем перезагрузки ДСК с рабочим буфером в обоих капиллярах. Соберите несколько прямых и обратных сканов в подходящем диапазоне температур при 1 градусе Цельсия в минуту с верхним временем балансировки 120 секунд.

Удалите предыдущие сканирования балансировки буфера в нижней части интерфейса, выделив каждое из них по отдельности и нажав красную букву «X» в середине правого угла интерфейса.

Добавьте новые сканы, нажав кнопку «Добавить серию», введя 20 в поле «Шаги для добавления» и установив флажок «Альтернативное отопление/охлаждение». Затем нажмите «ОК» и запустите эксперимент, нажав зеленую кнопку «Играть», как и раньше.

Повторите эти шаги с рабочим буфером, содержащим желаемую концентрацию лиганда в обоих капиллярах, чтобы получить контрольные эксперименты для лиганда. Соберите два отдельных эксперимента, которые будут использованы для получения константы скорости для термолабильного преобразования лиганда.

Для набора данных о свободной биомолекуле убедитесь, что референсный капилляр содержит рабочий буфер, в то время как образец капилляра содержит свободную биомолекулу в требуемой концентрации в рабочем буфере. Затем запустите примеры экспериментов, используя ту же процедуру загрузки DSC и экспериментальные параметры, что и в эталонных сканах.

Для экспериментов, связанных с лигандом, убедитесь, что лиганд находится в рабочем буфере в эталонном капилляре, а биомолекула плюс лиганд — в рабочем буфере в капилляре образца. Промывайте систему между добавлениями различных лигандов, как и раньше.

Провести еще один эксперимент со связанной с термолабильным лигандом биомолекулой, в котором период высокотемпературного равновесия увеличен до 600 секунд, а все остальные параметры эксперимента остаются такими же, как и раньше. Перейдите к обработке и анализу данных, как описано в текстовом протоколе.