Конкурентный анализ связывания для выявления соединений, нарушающих рецептор-лигандные взаимодействия

Анализ конкурентного связывания выявляет малые молекулы, которые нарушают взаимодействия рецептор-лиганд путем конкурентного связывания с рецептором-мишенью, ингибируя естественное связывание лиганда.

Чтобы идентифицировать взаимодействие рецептора с его природным лигандом в присутствии рецептор-специфичного низкомолекулярного антагониста, начните с суспензии клеток Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих рецептор-мишень.

Добавляйте клеточную суспензию в лунки многолуночного планшета, содержащего возрастающие концентрации антагонистов. Инкубировать. Антагонист связывается с ортостерическим сайтом связывания — естественным сайтом связывания лиганда рецептора.

Добавьте в лунки фиксированную концентрацию флуоресцентно меченных природных лигандов. Инкубировать.

При низких концентрациях антагонисты занимают несколько ортостерических участков связывания, что позволяет естественно связываться лигандом с рецепторами. Однако при более высоких концентрациях антагонисты занимают большую часть ортостерических сайтов связывания, обеспечивая минимальное естественное связывание лиганд-рецептор.

Центрифуга для гранулирования ячеек. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в параформальдегиде, чтобы зафиксировать их, сохранив клеточную морфологию.

С помощью проточного цитометра проанализируйте флуоресцентные сигналы от отдельных Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы-антагонисты и флуоресцентные лиганд-связанные рецепторы.

Дозозависимое снижение средней интенсивности флуоресценции с увеличением концентраций рецептор-специфических антагонистов указывает на конкурентное связывание антагонистов с ортостерическими рецептор-связывающими сайтами, ингибируя естественное лиганд-рецепторное взаимодействие.

Для начала налейте 100 микролитров раствора в прозрачную 96-луночную пластину с круглым дном в соответствии с заранее определенной экспериментальной схемой.

Добавьте 50 микролитров клеточной суспензии из резервуара с реагентом в 96-луночный планшет с помощью многоканальной пипетки. Выдержите тарелку в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.

После инкубации добавьте 50 микролитров флуоресцентно меченного 100 нанограмма на миллилитр CXCL12 из аналогичного резервуара с реагентами в лунки 96-луночного планшета. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре в темноте.

Затем центрифугируйте 96-луночный планшет при 400-кратной гравитации в течение 5 минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость из гранулированных клеток, перевернув пластину. Высушите пластину на салфетке. Добавьте в лунки 200 микролитров свежего буфера для анализа из резервуара с реагентом с помощью многоканальной пипетки.

Немедленно приступайте к центрифугированию планшета снова в течение 5 минут при 400-кратном течении силы тяжести при комнатной температуре. Снова удалите надосадочную жидкость, перевернув пластину, а затем высушите ее на салфетке. Наконец, аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 микролитрах 1% параформальдегида, растворенного в PBS. Этот шаг позволит закрепить клетки.

Чтобы проанализировать образцы с помощью проточной цитометрии, запустите прибор и откройте соответствующее программное обеспечение. Выберите параметры соты, которые будут визуализированы в формате точечного блоттинга: область прямого рассеяния, боковая область рассеяния и, в виде гистограммы, канал обнаружения флуорофора.

Выберите один образец, например, отрицательный контрольный образец, для выполнения стробирования определенной однородной популяции клеток на основе параметров прямого и бокового рассеяния. Адаптируйте настройки загрузки клеток в аппарат проточной цитометрии.

Перед инъекцией выберите три смеси. Выберите автоматический впрыск 100 микролитров фиксированных клеток, и используйте скорость потока образца 1,5 микролитра в секунду. Запустите пример, выбрав «Получить данные». Теперь на экране появятся параметры прямого и бокового рассеяния для этого образца, а также обнаружение флуорофора.

Теперь выберите инструмент гейтирования программного обеспечения. На основе визуализации графиков прямого и бокового рассеяния методом точечного блоттинга предварительно определите однородную и жизнеспособную популяцию клеток с помощью стробирования. Выберите для анализа 20 000 «событий» на выборку.

Это означает, что для каждого образца в конечном итоге будут проанализированы 20 000 клеток, которые попадают в заранее определенный вентиль. Сбор данных будет продолжаться до тех пор, пока не будет достигнуто это количество событий.

Начните спуск, выбрав сначала скважины для анализа. Затем выберите «Запустить скважины».

Теперь устройство проточной цитометрии будет анализировать эти образцы один за другим, записывая среднюю интенсивность флуоресценции для каждого образца, которая соответствует среднему флуоресцентному сигналу от 20 000 клеток, попадающих в заданный вентиль.

Наконец, выполните анализ данных, как описано в протоколе.