Репортерный анализ на основе ИФА для изучения взаимодействия рецептор-лиганд в клетках BW

Чтобы изучить рецептор-лигандные взаимодействия, начните с многолуночного планшета, содержащего среду с клетками-мишенями, экспрессирующими тестовые лиганды на своей поверхности.

Добавьте к этому сконструированные мышиные BW-клетки — новую популяцию B-клеток, экспрессирующую мембранно-связанные химерные рецепторы. Химерные рецепторы включают внеклеточный домен конкретного рецептора, слитый с трансмембранным и внутриклеточным сигнальным доменом рецептора В-клеток.

Лиганды на клетках-мишенях взаимодействуют с внеклеточным доменом химерных рецепторов клеток BW, вызывая активацию внутриклеточного сигнального домена в клетках BW. Это запускает нисходящую передачу сигналов и выработку цитокинов — секреторных репортерных молекул, которые высвобождаются за пределы клеток BW, появляясь в среде.

Центрифугируйте пластину. Перенесите содержащую цитокин надосадочную жидкость в планшет ИФА, предварительно покрытый антицитокиновыми антителами. Цитокины взаимодействуют с Fab-областями антител, что приводит к их иммобилизации на поверхности пластины.

Обработайте пластину блокирующим раствором для блокировки неспецифических мест связывания. Добавьте биотинилированные антицитокиновые антитела, которые взаимодействуют с предварительно связанными цитокинами и образуют иммунные комплексы.

Наложите на пластину конъюгированный с ферментом раствор стрептавидина. Стрептавидин связывается с биотином на иммунных комплексах.

Обработайте пластину субстратом. В результате взаимодействия фермента с субстратом получается окрашенный продукт, придающий раствору тот же цвет. Окрашенный раствор подтверждает наличие репортерных молекул, что указывает на успешное взаимодействие рецептор-лиганд.

Используйте 50 000 трансфицированных BW-клеток с их желаемыми мишенями в одной лунке 96-луночного планшета. Выдерживайте тарелку в течение 48 часов. Затем заморозьте тарелку при температуре -20 градусов по Цельсию.

Покройте планшет методом ИФА антителом против мышиного IL-2. Поместите 0,05% микрограмм анти-мышиного IL-2 в объеме 50 микролитров PBS в каждую лунку. Инкубируйте покрытую пластину в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

Используйте короткий инкубационный период при 37 градусах Цельсия, чтобы разморозить замороженные клетки БО, которые ранее инкубировались со своими мишенями. Затем центрифугируйте планшет и перенесите по 100 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки на планшет с предварительно покрытым покрытием ИФА и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2 часов.

После этого добавьте в пластину ИФА биотин анти-мыши-ИЛ-2. Затем, после инкубации и промывки, добавьте в тарелку HRP-конъюгированный стрептавидин. После инкубации и промывки добавьте по 100 микролитров раствора субстрата TMB в каждую лунку планшета ИФА. Наконец, считайте показания ИФА-планшета на 650 нанометрах.