Почему измерение силы разрыва связи важно для валидации мишени?

Измерение силы, необходимой для разрыва связей TCR-pMHC, позволяет количественно оценить стабильность взаимодействия, которая коррелирует с потенциалом активации Т-клеток и помогает отличить биологически значимые мишени от слабых связующих агентов.

Как выделение взаимодействия TCR-pMHC в качестве независимой переменной помогает в принятии решений при разработке конвейеров по поиску новых мишеней?

Путем контроля презентации лиганда и измерения зависимости разрыва связи от приложенной силы данный анализ выделяет взаимодействие TCR-pMHC в качестве ключевой переменной, что позволяет четко установить зависимости «структура — функция» для оптимизации ведущих соединений.

Какие количественные измерения позволяет проводить биомембранный силовой зонд для анализа рецептор-лигандных взаимодействий?

Зонд измеряет смещение микросферы и приложенную силу в режиме реального времени, что позволяет рассчитать силу разрыва связи, скорость нагружения и оценочное время жизни связи на основе кинетических моделей.

Почему требования к репликации важны для кросс-функционального сотрудничества при валидации мишени?

Воспроизводимые измерения силы в различных клетках и в ходе нескольких экспериментальных серий обеспечивают надежность данных, позволяя группам специалистов в области иммунологии, биофизики и разработки лекарственных средств согласовать критерии взаимодействия с мишенью.

Какие возможности статистического анализа необходимы перед внедрением анализа рецептор-лигандного взаимодействия на основе измерения силы?

Реализация требует умения анализировать кривые распределения сил, рассчитывать средние силы разрыва и применять кинетические модели, такие как модель Белла-Эванса, для извлечения параметров времени жизни связи из экспериментальных данных.

Биомембранный силовой зонд для количественного определения рецептор-лигандных взаимодействий

JoVE Encyclopedia of Experiments

Биологические методы

0 просмотров • 5:57 мин • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взаимодействие между Т-клеточным рецептором, TCR, и антигенным пептидом, представленным MHC, или главным комплексом гистосовместимости, на антигенпрезентирующей клетке, APC, заставляет Т-клетку оказывать механическое воздействие на APC. Это явление необходимо для активации Т-клеток.

Чтобы количественно оценить взаимодействия рецептор-лиганд с помощью биомембранного силового зонда, BFP, начните с пользовательской клеточной камеры на основе предметного стекла. Поместите камеру клетки под микроскоп.

Введите в камеру суспензии биотинилированных набухших эритроцитов, стеклянные шарики зонда, покрытые пептид-связанными комплексами MHC-стрептавидин-биотин, и Т-клетки. Расположите зонд, мишень и микропипетки, заполненные вспомогательным буфером, вокруг камеры.

Отасуньте биотинилированный эритроцит с помощью дозаторной пипетки, расположив его в пустой зоне. Аспирируйте Т-клетку с помощью целевой микропипетки, расположив ее справа от эритроцитов. Отсадите шарик зонда с помощью вспомогательной микропипетки и прикрепите его к вершине эритроцита. Стрептавидин шарика связывается с биотином эритроцитов и образует силовой зонд.

Выровняйте Т-клетку с силовым зондом, чтобы позволить TCR взаимодействовать со своим лигандом — связанным с MHC пептидом, а Т-клетке — оказывать воздействие на эритроциты. Втяните Т-клетку, чтобы разорвать TCR-пептидную связь, которая деформирует эритроциты и смещает шарик.

Измерьте силу, необходимую для разрыва связи — более прочная связь требует большей силы и больше времени для разрыва, что указывает на более длительный срок службы.

Чтобы начать эксперимент BFP, включите микроскоп и источник света. Поместите камеру на главный предметный столик микроскопа. Следующим этапом является установка всех трех микропипеток BFP. Щуп слева — это захват эритроцита. Цель справа — схватить клетку, а помощник справа внизу служит для захвата бусины.

Для установки с помощью микроинъектора заполните микропипетку экспериментальным буфером. Снимите микропипетку с держателя пипетки и держите ее в более низком месте, чтобы жидкость могла капать с наконечника. Быстро вставьте микропипетку в наконечник держателя, следя за тем, чтобы во время введения в микропипетку не попали микропузырьки воздуха.

Затяните винт держателя, затем установите каждый держатель пипетки на соответствующий микроманипулятор. Подтолкните микропипетку к камере так, чтобы их кончики вошли в буферную зону камеры. Отрегулируйте положение микропипеток и найдите их под полем зрения микроскопа.

Перемещайтесь по арене держателя камеры, чтобы найти колонии трех элементов одну за другой. Отрегулируйте положение соответствующей микропипетки, поворачивая ручки манипуляторов так, чтобы кончик микропипетки приблизился к одной ячейке или шарику. Отсасывайте клетку или шарик, регулируя давление внутри соответствующей микропипетки. Все три микропипетки будут захватывать соответствующие элементы.

Перемещайтесь вокруг ступеней держателя камеры, чтобы найти открытое пространство вдали от колоний вводимых элементов, где будет проводиться эксперимент.

Переключите визуальный режим микроскопа для визуализации изображения в компьютерной программе. Переместите все три элемента на наконечниках пипеток в поле зрения программы. Далее совместите валик щупа и эритроциты и осторожно переместите бусину щупа к вершине эритроцитов. Теперь кратковременно прижмите бусину к эритроциту и аккуратно втяните.

Отрегулируйте давление вспомогательной микропипетки, чтобы аккуратно сдуть бусину так, чтобы она осталась приклеенной к верхушке эритроцитов. Отодвиньте вспомогательную микропипетку в сторону, выровняйте мишень и бусину зонда.

В программе в окне «Поле зрения» с помощью инструментов программы измерьте соответствующие радиусы микропипетки зонда, эритроцитов и круговой зоны контакта между эритроцитами и шариком зонда. Эти значения позволяют оценить постоянную пружины эритроцитов по уравнению, приведенному в текстовом протоколе.

После ввода в программу желаемой пружинной константы эритроцитов нарисуйте горизонтальную линию поперек вершины эритроцита, в результате чего в соседнем окне получится кривая, указывающая яркость каждого пикселя вдоль этой линии. Перетащите пороговую линию примерно на половину глубины кривой.

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 22 августа 2026

Биомембранный силовой зонд для количественного определения рецептор-лигандных взаимодействий

Обзор

Основные компоненты исследования

Область науки

Теоретические основы

Цель исследования

Используемые методы

Основные результаты

Выводы

Часто задаваемые вопросы

Практическая значимость для промышленности

Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках

Первичное открытие и валидация мишени

Скрининг и разработка анализа

Трансляционные и доклинические исследования

Интеграция конвейеров и рабочих процессов

Операционное и корпоративное воздействие

Особенности реализации

Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике

Исследование рецептор-лигандных систем целлюлозосомы с помощью одномолекулярной силовой спектроскопии на основе АСМ

Измерение ТКР ПКИКЖ Связывание

Анализ молекулярной пружинной константы с помощью зондовой спектроскопии биомембранных сил

Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет

Использование зондов напряжения на основе ДНК для оценки рецепторных сил, прилагаемых иммунными клетками

Генетически-кодированные Молекулярные зонды по изучению G-белком

Количественный и качественный анализ взаимодействий между частицами Использование коллоидных Probe Наноскопия

В режиме реального времени измерения мембранного белка: рецептор взаимодействий с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Флуоресценции зонда биомембрана Сила: Параллельное Количественное рецептор-лиганд кинетики и привязка вызванной внутриклеточной сигнализации на одну ячейку

Выступ силовой микроскопии: Метод количественного определения сил, разработанный ячейки выступов