Анализ связывания конкуренции для изучения конкурирующих партнеров по ГТФазе

Гуанин-нуклеотид-связывающие белки — категория ГТФаз — функционируют как молекулярный переключатель, переключаясь между активной формой, связанной с ГТФ, и неактивной формой, связанной с ГДФ.

Активные ГТФазы связываются со специфическими белковыми партнерами. Эти партнеры конкурируют за один и тот же сайт связывания в GTPases.

Чтобы изучить конкурентное связывание, начните с приема суспензии ГТФ-связанной ГТФазы, иммобилизованной на магнитных шариках. Добавьте первого партнера по взаимодействию — флуоресцентно меченный белок А. Инкубируйте при перемешивании, чтобы шарики оставались во взвешенном состоянии. Белок А связывает и насыщает сайты связывания на всех молекулах ГТФазы.

Разделите этот раствор поровну на несколько трубок. Добавляйте в пробирки второго партнера по взаимодействию — флуоресцентно меченный белок B — в возрастающих количествах. Инкубируйте при перемешивании.

Белок В связывается с тем же сайтом связывания на ГТФазах, конкурентно вытесняя белок А.

Подвергните трубки воздействию магнитного поля, чтобы собрать бусины с одной стороны. Выбросьте надосадочную жидкость, чтобы удалить несвязанные белки. Ресуспендируйте гранулы с белковыми комплексами в подходящем буфере и