Анализ связывания конкуренции для изучения конкурирующих партнеров по ГТФазе

Гуанин-нуклеотид-связывающие белки — категория ГТФаз — функционируют как молекулярный переключатель, переключаясь между активной формой, связанной с ГТФ, и неактивной формой, связанной с ГДФ.

Активные ГТФазы связываются со специфическими белковыми партнерами. Эти партнеры конкурируют за один и тот же сайт связывания в GTPases.

Чтобы изучить конкурентное связывание, начните с приема суспензии ГТФ-связанной ГТФазы, иммобилизованной на магнитных шариках. Добавьте первого партнера по взаимодействию — флуоресцентно меченный белок А. Инкубируйте при перемешивании, чтобы шарики оставались во взвешенном состоянии. Белок А связывает и насыщает сайты связывания на всех молекулах ГТФазы.

Разделите этот раствор поровну на несколько трубок. Добавляйте в пробирки второго партнера по взаимодействию — флуоресцентно меченный белок B — в возрастающих количествах. Инкубируйте при перемешивании.

Белок В связывается с тем же сайтом связывания на ГТФазах, конкурентно вытесняя белок А.

Подвергните трубки воздействию магнитного поля, чтобы собрать бусины с одной стороны. Выбросьте надосадочную жидкость, чтобы удалить несвязанные белки. Ресуспендируйте гранулы с белковыми комплексами в подходящем буфере и количественно определите связанные белки.

Построить график относительных интенсивностей белков А и В, связанных с ГТФазой при каждой концентрации белка В.

Белок В достигает равновесия — занимая сайты связывания половины молекул ГТФазы — при относительно более низкой концентрации, чем белок А, что указывает на более высокое сродство белка В к ГТФазе.

Чтобы выполнить соревновательное связывание, установите шесть микрофуговых пробирок, каждая из которых содержит 200 микролитров буфера для связывания соревнований. Каждая пробирка также должна содержать 10 микролитров нуклеотидных гранул Rac1 и пять микролитров Rac1-связывающего белка А в качестве постоянного связывающего белка.

В каждую пробирку добавьте 0, 1, 2,5, 5, 10 или 20 микролитров Rac1-связывающего белка B в качестве переменного связывающего белка. Эти объемы предполагают примерно равные исходные концентрации постоянных и переменных связывающих белков и, возможно, потребуется скорректировать.

Доведите общий объем связующей смеси до 235 микролитров путем добавления конкурирующего связующего буфера. Затем установите микропробирку, содержащую 200 микролитров буфера для соревнований, 10 микролитров экспериментальных гранул Rac1, загруженных нуклеотидами, и 10 микролитров Rac1-связывающего белка А.

Затем настройте GDP, GTPγS и контрольные трубки без нуклеотидов, как описано в текстовом протоколе. Инкубируйте пробирки в течение двух часов, перемешивая путем инверсии при 4 градусах Цельсия. После инкубации трижды промойте бусины с помощью буфера для связывания соревнований.

Наконец, разбавьте связанные белки в 20 микролитрах буфера для редуцирующего образца.