Микрочип вирусного антигена для выявления изотипов антител в сыворотке крови против вирусного антигена

Начните анализ микрочипа вирусного антигена с подготовленного предметного стекла микрочипа вирусного антигена.

Предметное стекло содержит несколько прокладок, каждая из которых содержит один массив, содержащий сотни очищенных антигенов нескольких вирусных штаммов, напечатанных на пятнах, расположенных в сетке. Каждое пятно содержит один тип антигена, адсорбированный на трехмерной микропористой поверхности нитроцеллюлозы.

Закрепите затвор в камере для удобства работы на последующих этапах. Добавьте блокирующий буфер, содержащий белки, которые связываются с оставшимися поверхностями предметного стекла, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител с поверхностью.

Инкубируйте предметное стекло микрочипа с разбавленной сывороткой человека. Изотипы антител в сыворотке, специфичные для антигенов на предметном стекле, распознают и связываются с эпитопами антигенов.

Удалите сыворотку. Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела и белки на предметном стекле.

Добавьте конъюгированные с квантовыми точками вторичные смеси антител, каждая из которых имеет свою квантовую точку. Изотип-специфичные вторичные антитела специфически связываются с соответствующим изотипом сывороточных антител, связанных с антигенами на предметном стекле.

Используйте формирователь изображений с микрочипом для количественного определения связывания антител с антигенами в предметном стекле микрочипа.

При возбуждении на соответствующих длинах волн квантовые точки, связанные с вторичными антителами, возвращаются в основное состояние и излучают специфические флуоресцентные сигналы, которые обнаруживаются фотодетектором.

Интенсивность пятенчатой флуоресценции количественно определяет изотип сывороточных антител в сыворотке, связанной с индивидуальным антигеном.

После программирования программного обеспечения для печати с нужным протоколом запустите тираж. По завершении поместите незондированные предметные стекла микрочипов в светонепроницаемую коробку в шкафу с эксикатором при комнатной температуре.

Чтобы зондировать сыворотки на антитела на микрочипе, используйте зажимы, чтобы прикрепить прокладки микрочипа прокладкой вверх к зондирующим камерам и поместить камеры в рамки.

Будьте осторожны при сборке слайдов, так как они легко ломаются, и проверьте наличие протечек после регидратации. При необходимости разберите и снова соберите слайды для устранения протечек.

Регидратируйте стекла 100 микролитрами фильтрованного блокирующего буфера на лунку и разбавьте сыворотку в соотношении 1 к 100 в 100 микролитрах блокирующего буфера на образец. Затем инкубируйте регидратированные предметные стекла микрочипов и разбавленные сыворотки в течение 30 минут при комнатной температуре и от 100 до 250 оборотов в минуту на орбитальном шейкере.

В конце инкубации с помощью наконечников для пипеток, подключенных к вакуумной линии с колбой вторичного сбора, осторожно отсасывайте блокирующий буфер из угла каждой камеры, не касаясь прокладок, и немедленно добавьте разбавленные сыворотки к прокладкам, не позволяя прокладкам высохнуть. Затем поместите закрытые рамки в лотки с влажными бумажными полотенцами, запечатанными для поддержания влажности, и выдержите рамы на ночь при температуре 4 градуса Цельсия на качающемся шейкере.

Для мечения вторичных антител с помощью квантовых точек, конъюгированных с квантовыми точками, осторожно отсасывайте сыворотку, как только что продемонстрировано, и промойте стекла тремя промывками в 100 микролитрах свежего буфера T-TBS на лунку в течение 5 минут на орбитальном шейкере. Затем предметные стекла инкубируют со смесью вторичных антител, конъюгированных с квантовыми точками, а затем промывают три раза, как описано в протоколе, используя ту же технику, что и только что продемонстрированная.

После последней промывки осторожно выньте предметные стекла из камер, и аккуратно промойте их фильтрованной двойной дистиллированной водой, а затем поместите каждое предметное стекло в 50-миллилитровую пробирку. Затем высушите предметные стекла центрифугированием.

Чтобы получить изображения предметных стекол микрочипа, сначала включите портативный имидж-сканер и осторожно поместите предметное стекло лицевой стороной вниз в держатель предметного стекла в камере визуализации. Откройте программное обеспечение для обработки изображений и на вкладке «Настроить имидж-сканер» выберите подходящую конфигурацию слайда.

На вкладке «Управление изображением» выберите подходящий флуоресцентный канал и отрегулируйте время экспозиции и съемки в зависимости от реакционной способности сыворотки. Затем нажмите «Захват», чтобы начать получение изображения. В конце сбора данных используйте сетки, ориентированные на реперные маркеры, для обнаружения пятен массива.