Почему для выделения моноцитов предпочтительна негативная селекция?

Отрицательная селекция позволяет избежать прямого мечения моноцитов, сохраняя целостность поверхностных маркеров и функциональную готовность клеток для последующих анализов. Такой подход снижает количество артефактов активации и поддерживает физиологическую релевантность в исследованиях функций иммунной системы.

Как блокирование Fc-рецепторов повышает специфичность изоляции?

Антитела, блокирующие Fc-рецепторы, предотвращают неспецифическое связывание иммуноглобулиновых комплексов с моноцитами, что снижает риск ошибочного удаления целевой популяции. Этот этап повышает специфичность, гарантируя, что для магнитного удаления будут помечены только немоноцитарные клетки.

Какие количественные показатели позволяют оценить успех изоляции?

Жизнеспособность, выход и чистота после изоляции, оцениваемые с помощью проточной цитометрии по маркерам моноцитов CD14+CD16-, служат количественными критериями успеха. Эти показатели позволяют проводить сравнение между донорами и условиями обработки для обеспечения воспроизводимости.

Почему этапы повторения важны в процессе магнитной сепарации?

Повторяющиеся этапы магнитного разделения позволяют постепенно обогащать популяцию моноцитов за счет удаления остаточных клеток-загрязнений, которые не были удалены на предыдущих этапах. Такой итерационный подход повышает конечную чистоту и снижает вариабельность между отдельными выделениями.

Какие аналитические возможности необходимы перед внедрением данного метода изоляции?

Проточная цитометрия для фенотипирования моноцитов, тесты на жизнеспособность и микроскопия для визуальной оценки морфологии клеток необходимы для подтверждения качества выделения. Эти методы позволяют убедиться, что выделенная популяция соответствует стандартам чистоты и функциональности для последующего использования.

Выделение моноцитов из цельной крови методом иммуномагнитного негативного отбора

JoVE Encyclopedia of Experiments

Иммунология

0 просмотров • 4:27 мин • July 8th, 2025

Чтобы выделить моноциты, тип белых кровяных клеток, из цельной крови путем иммуномагнитного отрицательного отбора, получают обработанную антикоагулянтами человеческую кровь в пробирке. Добавьте раствор коктейля антител, содержащий антитела, блокирующие Fc-рецепторы, и биспецифические комплексы тетрамерных антител.

Каждый комплекс антител содержит два моноклональных антитела, причем одно антитело специфично для антигенов клеточной поверхности на немоноцитарных клетках, включая лейкоциты и эритроциты, а другое антитело специфично для декстрана.

Добавьте раствор магнитных шариков с покрытием из декстрана. Инкубировать. Антитело, блокирующее Fc-рецепторы, связывается с Fc-рецептором моноцитов, предотвращая неспецифическое связывание моноклональных антител.

Моноклональные антитела в комплексах антител распознают и связываются со специфическими антигенами клеточной поверхности на немоноцитарных клетках, оставляя моноциты непомеченными. Магнитные шарики, покрытые декстраном, связываются с антидекстрановыми антителами комплексов антител, сшивая немоноцитарные клетки с гранулами.

Поместите трубку в магнитный держатель. Под воздействием высокоградиентного магнитного поля сшитые магнитными шариками клетки связываются со стенками трубки, оставляя моноциты в центре трубки.

Пипеткой введите раствор, содержащий моноциты; переложите в свежую пробирку. Добавляем магнитные шарики, сшивая оставшиеся ненужные ячейки. Помещают под воздействие магнитного поля, обогащая популяцию моноцитов.

Переложите суспензию моноцитов в свежую пробирку. Центрифугируйте суспензию. Ресуспендируйте моноциты в буфере для дальнейшего анализа.

После сбора 40 миллилитров свежей цельной человеческой крови в четыре 10-миллилитровые вакуумные пробирки ЭДТА, используйте стерильную технику для переноса всей крови в одну 50-миллилитровую коническую пропиленовую пробирку в шкафу биобезопасности. Следуя инструкциям производителя из выбранного набора для выделения моноцитов человека, добавьте 2 миллилитра коктейля из набора для выделения моноцитов в пробирку с кровью и переведите магнитные шарики из набора на 30 секунд.

Добавьте 2 миллиметра шариков в кровь, и с помощью серологической пипетки объемом 25 миллилитров тщательно перемешайте шарики с кровью. Через пять минут при комнатной температуре разделите кровь поровну между четырьмя 50-миллилитровыми пробирками и добавьте в каждую пробирку 30 миллилитров стерильного PBS с добавлением 1 миллимоляра ЭДТА. Еще раз перемешайте пластиковой серологической пипеткой объемом 25 миллилитров и поместите пробирки в магнитные держатели.

Через 10 минут с помощью пипетки наберите содержимое из центра каждой пробирки, стараясь не отсасывать более 1 миллилитра эритроцитов, и распределите содержимое пробирки в одну из четырех новых 50-миллилитровых пробирок. Добавьте еще 500 микролитров вихревых магнитных шариков в каждую пробирку и аккуратно перемешайте клеточный раствор. Поместите пробирки обратно в магнитные держатели на пять минут, прежде чем осторожно перенести содержимое из центра каждой пробирки в одну из четырех новых 50-миллиметровых пробирок.

Когда все клеточные суспензии будут перенесены, поместите каждую новую 50-миллилитровую пробирку в магнитодержатели на пять минут, прежде чем осторожно перенести содержимое пробирки в третий набор из четырех новых 50-миллилитровых пробирок. Затем соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте все четыре клеточные гранулы в общей сложности 10 миллилитров стерильного PBS для подсчета.