Выделение лимфоцитов из пейеровского пятна мыши

Пейеровы пластыри, ПП, агрегаты организованных лимфоидных тканей в стенке тонкой кишки, содержат иммунные клетки, включая В-лимфоциты, Т-лимфоциты, дендритные клетки и макрофаги.

Чтобы выделить лимфоциты из ПП мыши, начните с усыпленной мыши. Надрезать брюшную стенку, обнажая брюшную полость. Найдите слепую кишку. Рассеките илеоцекальное соединение, чтобы отделить слепую кишку от тонкой кишки.

Иссеките брыжейку и разрежьте тонкую кишку в области двенадцатиперстной кишки, чтобы удалить тонкую кишку из брюшной полости. Поместите тонкую кишку в многолуночную пластину, содержащую охлажденную среду, и промойте, чтобы удалить мусор.

Расположите тонкую кишку брыжеечной стороной вниз и увлажните средой для поддержания гидратации тканей. Определите ПП — белые многодольчатые агрегаты на антибрыжеечной стороне стенки кишечника.

Тщательно иссекайте ПП, исключая окружающую кишечную ткань. Переложите в пробирку со средой. Инкубируют при постоянном перемешивании. Эта стадия перемешивания отделяет слизь, клеточный мусор и любые фекальные массы от ПП, тем самым улучшая восстановление лимфоцитов ПП.

Далее переложите ткань в клеточное ситечко с подходящим размером ячеек. Аккуратно разрушайте ПП и высвобождайте клетки. Промойте средой через ситечко до получения суспензии одноклеточных лимфоцитов. Центрифугируйте суспензию при низкой температуре для поддержания стабильности клетки.

Ресуспендируют лимфоциты в среду, и используют для дальнейшего анализа.

Начните с того, что поместите мышь в положение лежа на спине и простерилизуйте брюшную полость с помощью 70% этанола. Сделайте разрез живота по средней линии через кожу и брюшину от лобка до грудной клетки, чтобы открыть брюшную полость и найти слепую кишку и илеоцекальное соединение.

Сделайте разрез как можно дистальнее, в месте соединения отделите тонкую кишку от слепой кишки, а брыжейку разрежьте ножницами, чтобы аккуратно удалить всю тонкую кишку вплоть до пилорического сфинктера.

Отрежьте место соединения между привратником и двенадцатиперстной кишкой, чтобы полностью отделить тонкую кишку от брюшной полости, и поместите изолированную тонкую кишку в одну лунку шестилуночного планшета, содержащую холодную среду RPMI, дополненную 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота или FBS на льду. Затем аккуратно взбалтывайте ткани вручную, пока все сегменты не будут погружены в холодную среду.

Когда все кишки будут собраны, используйте щипцы, чтобы захватить брыжеечный жир с одного края кишечника и поместите образец брыжеечной стороной вниз на бумажное полотенце. Смочите весь кишечный сегмент RPMI плюс 10% FBS, чтобы избежать обезвоживания и липкости тканей, и найдите пейеровы пятна, которые выглядят как белые многодольчатые агрегаты с формой, похожей на цветную капусту, на антибрыжеечной стороне стенки кишечника.

Чтобы собрать пластыри Пейера, используйте изогнутые хирургические ножницы изогнутой стороной вверх, чтобы аккуратно вырезать каждый пластырь от его дистальных и проксимальных границ, стараясь исключить окружающую кишечную ткань, и поместите пластыри Пейера в отдельные лунки 12-луночного планшета, содержащего ледяной RPMI плюс 10% FBS, на льду по мере их сбора.

Когда все пластыри будут получены, с помощью ножниц отрежьте кончик наконечника микропипетки объемом 1 миллилитр так, чтобы его диаметр был достаточно большим для аспирации отдельных пейеровских пластырей, и перенесите пейеровы пластыри в 150-миллилитровую коническую трубку на мышь, содержащую 25 миллилитров 37 градусов Цельсия RPMI плюс 10% FBS.

Затем поместите пробирки в орбитальный шейкер при температуре 37 градусов Цельсия с непрерывным перемешиванием со скоростью от 125 до 150 об/мин в течение 10 минут. В конце перемешивания перенесите пейеровы пластыри на 140-микрометровый клеточный фильтр для каждой мыши и используйте резиновый конец 110-миллилитрового поршня шприца для каждого животного, чтобы аккуратно разбить пейеровы пластыри через сетку на отдельные 50-миллилитровые конические трубки.

Промойте фильтры 15-20 миллилитрами холодного RPMI плюс 10% FBS и соберите клетки центрифугированием. После тщательного удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в соотношении примерно 1 x 10⁷ клеток на миллилитр RPMI плюс 10% концентрация FBS для подсчета. Затем перенесите от 2 до 2,5 x 10⁶ ячеек на 200 микролитров среды, в каждую лунку с круглым дном на 96 лунок и гранулируйте ячейки центрифугированием.