Генерация незрелых, зрелых и толерогенных дендритных клеток из моноцитов

Чтобы вызвать иммунный ответ, дендритные клетки, ДК, представляют антиген, проявляемый MHC класса II и костимулирующими молекулами CD80 и CD86. В зависимости от характеристик иммунного ответа они подразделяются на незрелые, зрелые и толерогенные ДК.

Чтобы получить различные субпопуляции дендритных клеток in vitro, начните с многолуночного планшета, содержащего человеческие моноциты — иммунные клетки-предшественники в полной среде, содержащей факторы роста и цитокин IL-4 — сигнальную молекулу.

Инкубируйте клетки в течение длительного времени. Факторы роста и IL-4 индуцируют пролиферацию моноцитов и дифференцировку в незрелые ДК.

Незрелые ДК обладают рецепторами распознавания образов, PRR и экспрессируют молекулы с низким уровнем MHC класса-II и ко-стимулирующие молекулы, демонстрируя сниженную способность вызывать иммунный ответ.

Обработайте одну лунку, содержащую незрелые ДК, иммуномодулирующими средствами — витамином D3 и глюкокортикоидами. Эти иммуномодулирующие агенты подавляют экспрессию MHC класса-II и костимулирующих молекул. Это приводит к дифференцировке в толерогенные ДК — иммунорегуляторные клетки, предотвращающие преувеличенные или нежелательные иммунные реакции.

Другую лунку, содержащую незрелые ДК, обработайте липополисахаридом, ЛПС — антигеном. ЛПС взаимодействует с толл-подобным рецептором-4 клеток — PRR, инициирует сигнальный каскад и дифференцирует их в зрелые клетки. Эти клетки экспрессируют высокий уровень MHC класса-II, костимулирующие молекулы и PRR — эффективные для процессинга и презентации антигенов.

Наблюдайте за дифференциально обработанными лунками на предмет различных морфологических характеристик, представляющих подтипы дендритных клеток.

Посев четырех наборов CD14+ моноцитов в концентрации от 0,3 до 0,5 х 106 на миллилитр среды для культивирования клеток IL-4 в шестилуночные планшеты. Инкубируйте клетки в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5%_CO2. На 4 день извлеките из культуры 850 микролитров среды, и центрифугируйте.

Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 миллилитр среды для культивирования клеток. Добавьте клеточную смесь обратно в культуру. На 5-й день добавьте 1 микролитр витамина D3 и 1 микролитр дексаметазона на миллилитр среды в два набора для получения толерогенных моДХ.

На 6-й день добавьте 200 нанограмм на миллилитр GM-CSF и 200 нанограмм на миллилитр IL-4 во все наборы. Добавьте 1 микрограмм на миллилитр ЛПС в один из наборов, обработанных только GM-CSF и IL-4, для получения зрелых моДХ.

Добавьте 1 микрограмм на миллилитр ЛПС к одному набору толерогенных мод moDC для получения ЛПС-торогенных moDC. Наконец, на 7-й день соберите различные типы моDC, промыв чашку для культуры PBS-EDTA.