Выделение и очистка В-клеток из периферической крови человека

Чтобы провести иммуномагнитное отрицательное разделение В-клеток, соберите периферическую кровь человека в пробирку, содержащую антикоагулянт, чтобы предотвратить свертывание крови. Добавьте эритроциты, эритроциты, буфер для лизиса эритроцитов, чтобы лизировать эритроциты, не затрагивая другие клетки крови.

Центрифуга для осаждения неповрежденных, более плотных клеток крови из менее плотно лизированных эритроцитов, которые остаются в надосадочной жидкости. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в свежей среде.

Перенесите клетки в культуральную тарелку. Инкубируйте так, чтобы макрофаги и моноциты прилипли к пластине, в то время как неадгезивные клетки, включая В-клетки, остаются в суспензии.

Соберите клетки в суспензии в свежую пробирку. Центрифуга для гранулирования клеток и ресуспендирования их в буфере.

Добавьте раствор коктейля, содержащий биотинилированные антитела, специфичные для клеток крови, отличных от В-клеток. Антитела связываются с антигенами на поверхности не-В-клеток, оставляя В-клетки непомеченными.

центрифуга. Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую несвязанные антитела.

Добавьте раствор стрептавидин-сопряженных магнитных шариков. Во время инкубации стрептавидин на микрогранулах плотно связывается с биотинилированными антителами, связанными с не-В-клетками, образуя комплексы.

Поместите трубку в магнитное поле, чтобы приклеить связанные магнитными шариками не-В-клетки к стенкам трубки, оставляя В-клетки во взвешенном состоянии. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую чистые В-клетки, в пробирку.

Центрифугируйте и ресуспендируйте В-клетки в среде для дальнейшего последующего анализа.

Сразу после взятия образца крови объемом 10 миллилитров из срединной кубитальной вены в 15-миллилитровую пробирку, содержащую ЭДТА, обогащенную калием, несколько раз переверните трубку, чтобы предотвратить образование тромба. Затем добавьте в клетки 35 миллилитров буфера для лизиса автоклавированных эритроцитов для 5-минутной инкубации при комнатной температуре.

Когда через трубку можно будет наблюдать свет, центрифугируйте кровь и подтвердите наличие белой гранулы. Удалите остаточный лизис буфера с 10 миллилитров автоклава до PBS, и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах среды RPMI 1640

.

Поместите клетки в 10-сантиметровую чашку для культивирования для 30-минутной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Затем осторожно перекрутите чашку для культуры несколько раз и переложите плавающие клетки в пластиковую коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

После двух промывок центрифугированием повторно суспендируйте гранулу в концентрации от 5 до 10 x^{10 6} клеток на миллилитр в 200 микролитрах холодного буфера PBS и добавьте 5 микролитров биотинилированного коктейля антител против человека, специфичного для клеток крови, на 1 x 10⁶ клеток.

После 30-минутной инкубации на льду промыть клетки в 10-кратном избыточном объеме стерильных ПБС, а также повторно суспендировать гранулу в 5 микролитрах стрептавидин-конъюгированных микрогранул на 1 х 10⁶ клеток для 30-минутной инкубации на льду. В конце инкубации добавьте в клетки 2 миллилитра буфера PBS и поместите трубку на магнитную подставку на 8 минут при комнатной температуре.

Когда микрошарики прикрепятся к стенке трубки, осторожно перенесите надосадочную жидкость в новую коническую трубку, и добавьте в клетки еще 2 миллилитра буфера PBS. После второго сбора надосадочной жидкости соберите объединенные клетки центрифугированием и перенесите клетки в 5-миллилитровую полистирольную пробирку в свежем буфере PBS с концентрацией 1 x 10⁷ клеток на миллилитр.