Сортировка клеток на основе проточной цитометрии для различных циркуляционных популяций В-клеток

В зависимости от рецепторов клеточной поверхности циркулирующие В-клетки человека классифицируются как CD19-положительные наивные В-клетки, CD19 и CD27-положительные В-клетки памяти, а также CD19, CD27 и CD38-положительные плазматические клетки плазматов.

Чтобы отсортировать эти клеточные популяции, принимайте очищенную суспензию В-клеток. Инкубировать с антителами к иммуноглобулину человека G. Антитела блокируют Fc-рецепторы В-клеток, предотвращая связывание неспецифических антител.

Добавьте флуоресцентно меченые антитела, нацеленные на CD19, CD27 и CD38.

Анти-CD19 антитела связываются с рецепторами CD19, повсеместно экспрессируемыми на В-клетках.

Анти-CD27 антитела связываются с рецепторами CD27, экспрессируемыми на В-клетках памяти и плазматах плазматов.

Анти-CD38 антитела связываются с рецепторами CD38, экспрессируемыми на плазматических клетках плазматов.

Добавьте флуоресцентный ДНК-связывающий краситель в качестве маркера мертвых клеток.

Мертвые клетки демонстрируют потерю целостности мембраны, что позволяет клетке проникать красителю и связываться с двухцепочечной ДНК; живые клетки остаются неокрашенными.

Центрифуга для удаления несвязанных антител и красителей и ресуспендирования клеток в буфере FACS. Процедите клетки через ситечко для получения однородной суспензии и устранения комков.

С помощью проточного цитометра отсортируйте мертвые клетки от живых. В живых клетках экспрессия CD19, CD27 и CD38 отличает наивные В-клетки, В-клетки памяти и плазматические плазматические клетки.

После выполнения неспецифической блокировки добавьте по 1 мкг каждого антитела отбора из расчета 1 х^{10 6} клеток в пробирку с аккуратным перемешиванием в течение 30-минутной инкубации на льду. В течение последних пяти минут инкубации добавьте в клетки 5 микролитров 7-AAD. Затем добавьте в клетки 2 миллилитра свежего PBS и сделайте вихрь перед центрифугированием.

Повторно суспендируйте гранулу в свежем сортировочном буфере в концентрации от 1 до 5 x 10⁷ клеток на миллилитр и отфильтруйте элементы через сетчатое фильтр для клеток 40 микрон в новую 5-миллилитровую полистирольную трубку. Затем отсортируйте клетки с помощью проточной цитометрии в три 15-миллилитровые пробирки, содержащие 5 миллилитров свежей среды RPMI, чтобы собрать наивные В-клетки, В-клетки памяти и плазматические плазматические клетки плазмы.