Функциональная оценка В-клеток, секретирующих антитела, с помощью анализа ELISpot

В-клетки, секретирующие антитела, или ASC, представляют собой дифференцированные В-клетки, которые секретируют изотипы антител, включая IgG и IgM, для обеспечения защиты от патогенов.

Чтобы выполнить функциональную оценку ASC in vitro, начните с точечного иммуноферментного анализа. Возьмите планшет ELISpot, содержащий в основании мембрану из активированного поливинилиденфторида.

Инкубируйте лунки с фрагментами поликлональных антител, содержащими исключительно Fab-области без Fc-области антитела. Каждая область Fab имеет сайт связывания для конкретных изотипов антител — IgG или IgM, что позволяет идентифицировать оба изотипа.

Во время инкубации фрагменты антитела прикрепляются к мембране, что приводит к иммобилизации.

Покройте лунки запорными растворами, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. Засейте планшет активированными В-клетками, секретирующими антитела, и инкубируйте. ASC секретируют различные изотипы, включая IgG и IgM, которые связываются с мембраносвязанными фрагментами антител.

Промойте пластину буфером, чтобы удалить несвязанные секретируемые антитела. Обработайте некоторые лунки конъюгированными с ферментом антителами для обнаружения IgM, а другие — антителами для обнаружения IgG, и проведите инкубацию.

Обнаруженные антитела связываются с соответствующими изотипами, образуя иммунокомплексы.

Во все лунки добавьте колориметрические субстраты, которые взаимодействуют с ферментами и образуют на мембране пятна фиолетового цвета. Добавьте останавливающий раствор, чтобы остановить реакцию.

Цветное пятно, образующееся в каждой лунке, указывает на наличие изотипа конкретного антитела, коррелируя с секреторной активностью В-клеток.

Когда все клетки будут собраны, засейте субпопуляции в отдельные лунки 12-луночного клеточного планшета в концентрации от 1 до 10 x 10⁵ клеток на миллилитр в свежей среде RPMI. Затем активируйте В-клетки 5 микрограммами CpG (ODN 2006) из расчета 1 x 10⁶ клеток на миллилитр на лунку в инкубаторе для клеточных культур в течение пяти дней.

По окончании активации добавьте 30 микролитров 35% этанола в дистиллированную воду в каждую лунку пластин ELISpot на 30 секунд. Затем замените этанол в каждой лунке 150 микролитрами автоклавной воды двойной дистиллированной и инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы удалить остатки этанола. Проведите промывку PBS с последующим добавлением 50 микролитров поликлонального фрагмента F(ab')2 античеловеческого Ig в каждую лунку.

Вымойте тарелки два раза с помощью PBS, как только что продемонстрировано. Блокируйте неспецифическое связывание в каждой лунке 200 микролитрами свежего PBS с BSA на два часа при комнатной температуре. После очередной серии промывки PBS инкубируйте лунки в 100 микролитрах свежей среды RPMI 1640 при температуре 37 градусов Цельсия. Затем замените среду в каждой лунке ELISpot соответствующим количеством активированных В-клеток.

Доведите конечный объем каждой лунки до 150 микролитров с помощью свежей среды RPMI. Затем верните планшет ELISpot в инкубатор для клеточных культур на 8–14 часов. В конце инкубационного периода выбросьте среду, а лунки промойте 200 микролитрами PBS плюс Tween 20 в течение пяти 3-минутных промывок.

После последней промывки добавьте соответствующие антитела обнаружения в соответствующие лунки, и инкубируйте пластины в течение двух часов в темноте. После очередной серии промывки PBS добавьте по 50 микролитров субстрата BCIP/NBT в каждую лунку на 5-15 минут при комнатной температуре.

При появлении фиолетовых пятен остановите реакцию 100 микролитрами дважды дистиллированной воды на лунку, и промойте пластину проточной водой из-под крана. Затем высушите мембраны ELISpot на воздухе, защищенные от света.