Дифференцировка стромальных клеток костного мозга мышей in vitro в адипоциты

Адипоциты, или клетки, накапливающие жир, являются преобладающими клетками жировой ткани, которые секретируют адипокины — иммунные сигнальные молекулы, регулирующие иммунный ответ.

Для получения адипоцитов in vitro начинают с многолуночного планшета, содержащего адгезивную культуру стромальных клеток костного мозга мыши, BMSCs, — недифференцированных мультипотентных клеток.

Обработайте клетки средой для индукции адипоцитов, содержащей ингибиторы фермента фосфодиэстеразы и дексаметазон — синтетический глюкокортикоид — для запуска дифференцировки клеток.

Ингибиторы проникают в клетки и дезактивируют циклические нуклеотидные фосфодиэстеразы, ферменты, необходимые для разрушения циклического аденозинмонофосфата, или цАМФ. Это ингибирование приводит к повышению внутриклеточного уровня цАМФ, что имеет решающее значение для дифференцировки клеток.

Дексаметазон связывается с внутриклеточными рецепторами в BMSC и проникает в ядро для активации генов, участвующих в синтезе и накоплении липидов. Это индуцирует дифференцировку BMSC в преадипоциты — клетки-предшественники зрелых адипоцитов.

Замените отработанную среду свежей индукционной средой для поддержания преадипоцитов. По истечении определенного периода времени обработайте клетки средой с адипоцитарным основанием, содержащей высокое содержание глюкозы и инсулина.

Инсулин связывается со специфическими рецепторами клеточной поверхности и активирует транслокацию транспортеров глюкозы на поверхности клетки, способствуя усвоению глюкозы преадипоцитами. Клетки используют избыток глюкозы для синтеза липидных капель, что приводит к адипогенезу — процессу накопления липидов, который способствует дифференцировке в зрелые адипоциты.

Обработайте клетки красителем, окрашивающим липиды, и понаблюдайте за ними под световым микроскопом. Зрелые адипоциты выглядят как круглые клетки с множественными красными липидными каплями.

Чтобы индуцировать дифференцировку адипоцитов стволовыми клетками костного мозга, замените среду для культивирования клеток костного мозга сливающейся культуры клеток костного мозга средой, индукционной средой для адипоцитов. После двух дней культивирования замените надосадочную жидкость свежей средой, индукционной адипоцитами, перейдя на среду на основе адипоцитов на 4-й день. На 7-й день подтвердите, что клетки накопили липидные капли и что проявление фенотипа похоже на зрелые адипоциты.