Культивирование активированных Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови человека

Множественные взаимодействия рецептор-лиганд между наивными Т-клетками и антигенпрезентирующими клетками, АПК, вызывают активацию и пролиферацию Т-клеток.

Два основных события в этом процессе включают распознавание антигена, экспрессируемого APC, комплексом рецепторов CD3-T-клеток, с последующим взаимодействием между лигандом B7, экспрессируемым APC, и рецептором CD28 Т-клеток.

Для изучения активации и пролиферации Т-клеток in vitro берут мононуклеарные клетки периферической крови человека, PBMC, суспендированные в подходящей питательной среде. Добавьте магнитные шарики, покрытые анти-CD3 и анти-CD28 антителами, и разделите клетки на две конические трубки.

Добавьте цитокин интерлейкин-2, ИЛ-2, в первую пробирку и интерлейкин-15, ИЛ-15, в другую. Перенесите ячейки в многолуночный планшет. Инкубировать.

Анти-CD3 и анти-CD28 антитела гранул связываются с комплексом рецепторов CD3-Т-клеток и рецептором CD28, экспрессируемыми на Т-клетках, соответственно, вызывая активацию и пролиферацию Т-клеток.

С IL-2 цитокин связывается со своим рецептором на поверхности активированных Т-клеток, что приводит к его дифференцировке и пролиферации в эффекторные Т-клетки. И наоборот, IL-15 в первую очередь стимулирует дифференцировку и пролиферацию Т-клеток в Т-клетки памяти.

Ресуспендируйте и перенесите половину клеток в новые лунки, чтобы обеспечить рост клеток. Добавьте свежую среду, содержащую IL-2 или IL-15, для поддержания популяций цитокин-дифференцированных Т-клеток для последующего анализа.

Для начала промойте гранулы CD3/CD28, переложив 12,5 микролитров гранул на миллион клеток в микроцентрифужную пробирку и добавив 12,5 микролитров PBS на 12,5 микролитров гранул в пробирке. Затем поместите микроцентрифужную пробирку на подходящий магнит на 1 минуту, выбросьте буфер и снова суспендируйте гранулы в исходном объеме Т-клеточной среды.

Затем добавьте 12,5 микролитров гранул на миллион клеток в соотношении 1 к 2 бусинам и разделите клетки на два состояния, в каждом из которых содержится около 5 миллионов клеток. Затем добавьте правильный объем цитокинов к каждому состоянию и перенесите клетки в многолуночные планшеты. Инкубируйте клетки в течение трех дней при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе.

После трех дней инкубации готовят свежую Т-клеточную среду с удвоенной концентрацией цитокинов. Повторно суспендируйте и разделите ячейки, перенеся половину объема из каждой лунки в новую лунку. Затем добавьте в каждую лунку одинаковое количество свежеприготовленной Т-клеточной среды.