Зачем требуется обработка коллагеназой для выделения лимфоцитов из тканей печени?

Коллагеназа расщепляет внеклеточный матрикс для высвобождения захваченных лимфоцитов и других мононуклеарных клеток из богатой коллагеном паренхимы печени. Этот ферментативный этап необходим для преодоления жесткости ткани и обеспечения эффективной диссоциации клеток перед разделением по плотности.

Как разделение с помощью силикатных микросфер с PVP-покрытием повышает выход лимфоцитов?

Силикатные бусины с PVP-покрытием селективно связывают адипоциты и жиросодержащие клетки, что позволяет удалить их с помощью низкоскоростного центрифугирования. Этот этап обеднения снижает уровень загрязнения и обогащает популяцию лимфоцитов в супернатанте для последующего центрифугирования в градиенте плотности.

Для чего необходимо собирать интерфазу после центрифугирования в градиенте плотности?

Сбор интерфазы позволяет выделить лимфоциты, включая NK-клетки, на основании их плавучей плотности между плазмой и градиентной средой. Этот этап отделяет мононуклеарные клетки от эритроцитов и гранулоцитов, которые оседают на дно пробирки.

Почему выделение лимфоцитов из тканей печени представляет ценность для исследований по экспансии NK-клеток?

Лимфоциты печени служат источником тканерезидентных NK-клеток, которые можно экспандировать в селективных средах для изучения их эффекторных функций. Использование очищенных лимфоцитов в качестве исходного материала обеспечивает стабильность условий для протоколов экспансии и снижает вариабельность в последующих анализах цитотоксичности.

Какие аналитические данные могут быть получены из изолированных лимфоцитов печени для подтверждения валидации мишени?

Изолированные лимфоциты можно исследовать на экспрессию поверхностных маркеров (например, CD56, CD16) и функциональный ответ, такой как дегрануляция (CD107a) и секреция цитокинов. Эти измерения позволяют количественно сравнить активность NK-клеток при различных экспериментальных условиях или при воздействии различных соединений.

Выделение естественных клеток-киллеров из ткани печени для селективной экспансии

JoVE Encyclopedia of Experiments

Иммунология

0 просмотров • 4:17 мин • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы выделить естественные клетки-киллеры, или NK-клетки — специализированные белые кровяные клетки, участвующие во врожденном иммунитете, — начните с ткани печени человека, содержащей различные клеточные популяции, включая жиросодержащие клетки, эритроциты, гранулоциты, лимфоциты и другие связанные клетки, заключенные в богатый коллагеном внеклеточный матрикс или ВКМ.

Нарежьте ткань небольшими кусочками и перенесите их в пробирку, содержащую коллагеназу — протеолитический фермент. Коллагеназа расщепляет коллаген, разрушает матрикс и разрыхляет клетки, связанные с ВКМ.

Вставьте трубку в диссоциатор тканей. Эта механическая диссоциация еще больше разрушает ECM, высвобождая слабо прикрепленные клетки в раствор. Отфильтруйте содержимое, чтобы удалить непереваренную ткань и фрагменты ВКМ и собрать фильтрат, содержащий различные клетки.

Ресуспендируйте клетки в буфер, содержащий поливинилпирролидон или гранулы диоксида кремния, покрытые PVP. Шарики ПВП избирательно связываются с жиросодержащими клетками, эффективно отделяя их от остальных клеток.

Центрифугируйте на низкой скорости для гранулирования клеточной популяции; выбросьте надосадочную жидкость, содержащую мусор и жировые клетки, связанные с гранулами. Повторно суспензируйте гранулу и наложите клеточную суспензию на трубку, содержащую среду с градиентом плотности, чтобы разделить клетки в зависимости от их плотности.

Центрифуга на низких оборотах. Эритроциты и гранулоциты более высокой плотности располагаются на дне, в то время как лимфоциты появляются на стыке между двумя жидкостями.

Соберите интерфазные клетки и культивируйте их в селективной среде для экспансии NK-клеток.

Начните с определения и разрезания жизнеспособных участков тканей с помощью стерильного хирургического оборудования для получения лимфоцитов. Затем поместите разрезанные ткани в 30 миллилитров HBSS без кальция или магния и держите ткань на льду до тех пор, пока она не будет готова к изоляции.

Работая внутри шкафа биобезопасности, измельчите салфетку в кубики размером менее 0,5 сантиметра с помощью стерильных бритвенных лезвий и щипцов. Поместите измельченные кусочки салфетки — не более 4 граммов — в пробирки для диссоциатора тканей и добавьте к тканевым кусочкам 10 миллилитров коллагеназы внутривенно.

Чтобы тщательно измельчить ткань, обработайте трубки диссоциатора тканей в диссоциатор тканей при температуре 37 градусов Цельсия. После извлечения трубок из диссоциатора тканей растирайте измельченную ткань через 40-микронный нейлоновый клеточный фильтр с помощью заднего конца 5-миллилитрового шприца. Выбросьте крупные, непереваренные фрагменты.

Уменьшите объем собранного элюента до 400 г в течение 5 минут при комнатной температуре и аспирируйте надосадочную жидкость перед тем, как повторно суспендировать клеточные гранулы в 30% диоксиде кремния, покрытом поливинилпирролидоном, чтобы удалить жировые клетки. Поверните клетки вниз, как описано, прежде чем снова суспендировать клеточную гранулу в 9 миллилитрах среды R-10.

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 15 августа 2026

Выделение естественных клеток-киллеров из ткани печени для селективной экспансии

Обзор

Основные компоненты исследования

Область науки

Теоретические сведения

Цель исследования

Используемые методы

Основные результаты

Выводы

Часто задаваемые вопросы

Практическая значимость для отрасли

Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках

Раннее открытие и валидация мишени

Скрининг и разработка анализа

Трансляционные и доклинические исследования

Интеграция конвейеров и рабочих процессов

Операционное и организационное воздействие

Особенности реализации

Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике

Проточной цитометрии на основе анализа на мониторинге NK клеточных функций

Изоляция и расширение цитотоксических цитотинов индуцированных Killer T-клеток для лечения рака

Анализ естественного метаболизма клеток-убийц человека

Расширение, очистки и функциональной оценки периферической крови человека клетки NK

Выделение CD133 + печень стволовых клеток для клональной экспансии

Ex vivo Экспансия естественных клеток-киллеров из мононуклеарных клеток периферической крови

Выделение инвариантных естественных киллеров Т-клеток из мышиной модели

Купфер Выделение клеток для наночастиц токсичности тестирования

Протокол для изоляции первичных гепатоцитов человека и соответствующие основные популяциями Non-паренхиматозных клеток печени

Оптимизированная метод выделения и расширение Инвариантные естественных киллеров Т-клеток из селезенки мыши