Ex vivo Экспансия естественных клеток-киллеров из мононуклеарных клеток периферической крови

Естественные киллеры, NK-клетки, представляют собой крупные зернистые лимфоциты, которые устраняют опухоли и микробные инфекции.

Для экспансии NK-клеток ex vivo берут суспензию мононуклеарных клеток периферической крови, PBMCs, содержащих гетерогенную популяцию лимфоцитов, включая NK-клетки. Добавьте облученные фидерные клетки — непролиферирующие лимфобластоидные клетки, которые экспрессируют мембраносвязанный интерлейкин 21, mIL-21, необходимый для активации и расширения NK-клеток.

Добавьте сокультуру в специализированную культуральную лунку с газопроницаемой мембраной на дне, обеспечивающей газообмен. Клетки успокаиваются и размножаются в течение длительного периода времени, не требуя пассирования.

Добавьте интерлейкин 2, ИЛ-2 и интерлейкин 15, ИЛ-15 — цитокины для пролиферации NK-клеток. Инкубируются в течение адекватного периода в физиологических условиях.

mIL-21 на фидерных клетках связывается со специфическим гетеродимерным рецептором на NK-клетках. Экзогенные IL-15 и IL-2 связываются со своими соответствующими рецепторами. Связывание индуцирует различные нисходящие сигнальные пути — активируя экспрессию генов, ограничивая клеточное старение и приводя к длительной пролиферации NK-клеток.

С помощью проточной цитометрии оцените экспансию NK-клеток через равные промежутки времени.

Построение графика записанных данных для анализа скорости расширения клеток и их чистоты — избирательного роста целевого типа NK-клеток. Многократное расширение в течение инкубационного периода указывает на устойчивую пролиферацию при сохранении высокой чистоты.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и 100 гамма-облученных клеток 221-mIL-21 по отдельности центрифугированием при 400 г в течение 5 минут с 10 мл среды R-10.

После центрифугирования сохраните 1 x 10⁶ PBMC для проточной цитометрии и смешайте 5 x 10⁶ PBMC с 10 x 10⁶ 100 гамма-облученными 221-mIL-21 клетками в специальном 6-луночном планшете. Добавьте в ту же 6-луночную пластину 30 миллилитров среды R-10 с добавлением человеческого интерлейкина-2 и человеческого интерлейкина-15, и инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом с заменой среды каждые три-четыре дня.

Во время инкубации записывайте общее количество естественных киллеров периферической крови или PBNK-клеток, жизнеспособность и проводите проточную цитометрию каждые три-четыре дня, чтобы рассчитать скорость роста NK-клеток.