Формирование иммунологических синапсов между Т-хелперами и антигенпрезентирующими клетками

Иммунные клетки взаимодействуют друг с другом посредством взаимодействия нескольких рецепторов, образуя специализированный узел — иммунологический синапс. Этот синапс служит местом обмена сигнальными молекулами, необходимыми для иммунного ответа.

Для изучения формирования иммунологических синапсов in vitro начните с микролуночного стекла с покрытием из базальной матрицы, содержащего адгезивную культуру активированных антигенпрезентирующих клеток человека, АПК.

Активированные АПК представляют на своей поверхности антигены, связанные с основным комплексом гистосовместимости или молекулами MHC-II, необходимыми для активации Т-клеток. Эти клетки помечены синим флуоресцентным красителем для легкой идентификации.

Обработайте лунки рекомбинантными человеческими хелперами Т-лимфоцитами. Эти Т-хелперы экспрессируют зеленые флуоресцентные мембранные белки, меченные белками — CD63, обнаруженные в секреторных везикулах. Это позволяет отслеживать секреторные пузырьки.

Т-клеточные рецепторы лимфоцитов взаимодействуют с комплексами MHC-антиген на APC, приближая Т-хелперные Т-лимфоциты к антигенпрезентирующим клеткам, что приводит к конъюгации.

При конъюгации костимулирующие сигнальные молекулы на АПК взаимодействуют с рецепторами лимфоцитов, образуя кластер вокруг сайта конъюгации, создавая иммунологический синапс.

Образование синапсов запускает реорганизацию цитоскелета лимфоцитов, включающую репозиционирование элементов цитоскелета — актиновых филаментов и микротрубочек. Эта реорганизация облегчает движение везикул к синапсу рядом с APC.

Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом. Запишите движение зеленых везикул внутри Т-хелперной клетки к синим АПК, подтверждая образование иммунологических синапсов.

Достаньте из инкубатора предметные стекла камеры, содержащие клеточный трекер с синей меткой Staphylococcus Enterotoxin E-pulsed, адгезивные клетки Raji. Осторожно отсасывайте питательную среду из каждой лунки, одну за другой, с помощью пипетки, расположенной в углу лунки.

Немедленно замените среду 200 микролитрами ресуспендированных клеток Юрката в среде для культивирования клеток. Если проводится таймлапс, быстро приступайте к микроскопу.

Найдите предметное стекло камеры на предметном столике микроскопа и выберите несколько подходящих полей.

Перед получением изображения подготовьте микроскоп в инкубационной камере. После того, как ячейки Jurkat были добавлены в каждую лунку, содержащую клетки Раджи, быстро найдите предметное стекло камеры микролунки на предварительно нагретом настольном инкубаторе микроскопа и выберите несколько положений XY.

Если планируется только эксперимент с конечной точкой, инкубируйте предметное стекло камеры при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 1-2 часов. После периода культивирования проверьте образование конъюгатов и впоследствии зафиксируйте конъюгаты, как указано в текстовом протоколе.